芽孢杆菌B55 产羧甲基纤维素酶的培养优化研究

张佳雯，王玉芳，张忠民，卢 宽，鲁仪增，程仕伟*

1.鲁东大学生命科学学院烟台市生物发酵与分离工程实验室，山东 烟台 264025；2. 烟台职业学院，山东 烟台 264670；3. 山东省林草种质资源中心，山东 济南 250102

木质纤维素是世界上最丰富的可再生资源，占全球生物总量的80%以上，是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，纤维素酶可以将纤维素转化成可利用性糖类，是开发利用木质纤维素的关键[1-2]。纤维素酶是一类可以水解β-1，4 葡萄糖苷键，使纤维素分解为纤维二糖和葡萄糖的酶系总称，包括内切葡萄糖苷酶（endoglucanase，EC 3.2.1.4，又称羧甲基纤维素酶）、外切葡萄糖苷酶（cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91，又称微晶纤维素酶）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）[3-4]。羧甲基纤维素酶（CMCase）是内切型纤维素酶，作用于纤维素的β-1，4 糖苷键上，其活力会直接影响纤维素的水解效率[5]。

纤维素酶除了可用于木质纤维素降解，在酿造、饲料、中药提取、纺织、造纸、洗涤等行业领域也得到了广泛应用[6-8]。作为目前糖苷酶类中尚存在大量亟待解决问题的一类酶，如何提高酶的活力并研发适应催化条件的纤维素酶成为了当前的主要研究趋势[9]。随着亿万年的自然演化，众多产纤维素酶的细菌、真菌和放线菌等被陆续发现[10-11]。作为芽孢杆菌类细菌来源的纤维素酶拥有耐热、耐碱等优良催化特性，近年来其在饲料添加剂等领域的应用备受重视[12-13]。芽孢杆菌所产的纤维素酶以羧甲基纤维素酶为主[14]。本文通过对分离自近海土壤中能降解羧甲基纤维素的芽孢杆菌B55 培养优化过程的研究，挖掘其产CMCase 的潜力，以期为后续的相关应用性研究提供数据依据和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

分离筛选自山东烟台近海土壤的芽孢杆菌（Bacillus sp.）B55，现保存于鲁东大学应用微生物研究所。羧甲基纤维素（CMC）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，其余所用试剂均为分析纯或生物纯。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

试管斜面保藏的Bacillus sp. B55 转接活化培养基，在30 ℃、200 r/min 的条件下培养至菌体浑浊。活化培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L氯化钠，pH 6.5，121 ℃灭菌15 min。

1.2.2 培养优化

将一定量的活化菌种接入发酵培养基，在30℃、200 r/min 的条件下，确定碳源、氮源和金属盐、CMC 添加量、接种量对菌种产CMCase 的影响，发酵培养24 h 后测定CMCase 的活力。根据影响因素的优化结果，正交试验确定菌株B55 产CMCase 的最佳变量值，通过最佳培养工艺确定最佳产酶条件。

1.2.3 酶活和菌浓测定[15]

培养液经10 000 r/min 离心5 min 去菌体后获得上清酶液，取1 mL 适当稀释度的酶液，在其中添加1 mL1% CMC 底物溶液，45 ℃水浴保温反应20 min 后，加入3 mLDNS 试剂，沸水浴5 min 显色并定容至25 mL 后，取4 mL 反应样液以8 000 r/min 离心5 min。取离心后的上清液，在540 nm 处测定吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算酶活力。以单位体积（mL）、单位时间（min）水解羧甲基纤维素所产生葡萄糖的μg 数为酶活力单位。

发酵培养液加纯净水稀释至适当浓度，并以纯水作为空白对照，在600 nm 处测定吸光度，以OD600指示菌体浓度。

2 结果与讨论

2.1 碳源对菌株B55 产CMCase 影响

采用发酵培养基：20 g/L 碳源，2 g/L CMC，5 g/L酵母浸粉，10 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 条件下摇床培养24 h，碳源对菌株产CMCase 活性影响见图1。结果显示，以甘油为碳源时获得最大CMCase活性146.45 U/mL，其次为葡萄糖（130.27 U/mL）。

图1 碳源对菌株产CMCase 的影响

2.2 氮源对菌株B55 产CMCase 影响

采用发酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 氮源，2 g/L CMC，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养24 h，氮源对菌株产CMCase 活性的影响见图2。由图中结果可知，最佳产酶氮源为大豆蛋白胨，产酶量为153.24 U/mL；酵母粉、尿素、磷酸氢二铵为氮源时，CMCase 产量也相对较高。

图2 氮源对菌株产CMCase 的影响

2.3 金属盐对菌株B55 产CMCase 影响

选取发酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，2 g/L CMC，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，3 g/L 金属盐，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养24 h，金属盐对菌株产CMCase 活性的影响见图3。由图3 可以看出，额外再添加金属盐会对菌株产CMCase 的活力产生负影响；与对照组相比，添加金属盐组的CMCase 活力均得到了不同程度的降低。

图3 金属盐对菌株产CMCase 的影响

2.4 CMC 添加量对菌株B55 产CMCase 影响

纤维素酶属于水解酶，多为诱导酶，合适的诱导物添加量可以显著提升纤维素酶的产量[16]。选用发酵培养基：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，不同浓度的CMC，pH 7.0。在30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养24 h，诱导物CMC 对菌株产CMCase 活性的影响见图4。由图4 可以看出，随着底物CMC 添加量的增加，酶活性逐渐增加，当诱导物添加至一定量时，即质量浓度为2～4 g/L 时，酶产量相对稳定，其中添加量为4 g/L CMC 时可获得最大CMCase 活力，为166.69 U/mL。

图4 CMC 量对菌株产CMCase 的影响

2.5 接种量对菌株B55 产CMCase 影响

选取如下培养基组分：20 g/L 甘油，15 g/L 大豆蛋白胨，3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，4 g/L CMC，pH 7.0。装液量100 mL/500 mL 瓶，每瓶接种不同量的活化菌种，在30 ℃、200 r/min 的条件下摇床培养24 h，确定接种量对菌株B55 产CMCase 的影响。由图5 可以看出，菌株B55 产CMCase 的最佳接种量是4%（V/V），酶活力为167.24 U/mL。

图5 接种量对菌株产CMcase 的影响

2.6 正交试验优化

根据对菌种进行单因素优化所得出的结论，选取甘油、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母粉、CMC、接种量、温度等7 项变量进行7 因素2 水平的正交试验设计，其因素和水平见表1。

表1 正交试验的因素水平 单位：g/L

根据所列的7 因素和2 水平的条件，利用正交试验设计软件进行正交试验设计，结果见表2。

表2 正交试验结果与分析

根据极差R 值分析可知，在正交试验的7 个因素中，甘油对菌株CMCase 产量的影响最大，其次是酵母粉、接种量、培养温度、大豆蛋白胨和葡萄糖。通过对k1、k2值的比较分析，确定7 个因素的最佳变量值分别为30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、4%（V/V）接种量和培养温度32 ℃。

2.7 发酵培养曲线

结合培养因素对菌株产酶的影响和正交试验优化结果，确定Bacillus sp. B55 发酵生产CMCase 的最佳培养组分为30 g/L 甘油、5 g/L 葡萄糖、3 g/L 大豆蛋白胨、16 g/L 酵母浸粉、4 g/L CMC、3 g/L 磷酸氢二钾，3 g/L 磷酸二氢钠，pH 7.0；最佳发酵条件为4%（V/V）接种量、培养温度32 ℃、装液量100 mL/500 mL。采用优化过的培养工艺，Bacillus sp.B55 发酵生产羧甲基纤维素酶的培养曲线见图6，在经短暂停滞期后快速进入对数生长期，在36 h 时菌体浓度达到最大，为45.32（OD600），随后进入静止期，菌体浓度缓慢下降。

图6 Bacillus sp. B55 发酵过程曲线

对CMCase 而言，在菌体快速增殖阶段，酶表达量会随菌体浓度增加而快速上升，当菌体生长进入静止期后，酶活性仍呈增长趋势，在发酵48 h 时获得最大酶活性401.34 U/mL。因此，Bacillus sp. B55生产CMCase 的过程为非生长偶联型（滞后合成型），会受到分解代谢物的阻遏。发酵时间超过66 h后，菌体开始自溶，酶活性快速降低。

3 结语

芽孢杆菌属微生物具有较强的耐热性，所产纤维素酶多为碱性纤维素酶，因此在饲料、洗涤、食品等领域得到了广泛应用[17]。本研究首先优化确定了Bacillus sp. B55 产CMCase 的影响因素，并在此基础上通过正交试验确定各变量因素的最佳变量值。研究结果显示，使用优化的培养工艺发酵生产CMCase，发酵36 h 可获得最大菌体浓度45.32（OD600），48 h CMCase 活力为401.34 U/mL。该研究成果可为后续进行规模化制备与催化特性研究提供良好的数据支撑。此外，本研究所用的产酶菌株为耐热芽孢杆菌，属于潜在益生菌，可将CMCase 和Bacillus sp. B55 菌体一并作为饲用微生态制剂用于饲料行业。