运动发酵单胞菌鼓风干燥工艺

2024-02-29 07:36姜学权汪浩勇
工业微生物 2024年1期
关键词:鼓风保护剂乳糖

姜学权,汪浩勇

湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北 武汉 430068

运动发酵单胞菌是一种高效的乙醇生产菌株,有许多理想的工业生物催化剂特性[1]。它的代谢途径已得到广泛研究,有助于揭示其高乙醇生产率和耐受性的机制。

目前,微生物的干燥方法通常包括冷冻干燥、喷雾干燥和真空干燥[2]。相比其他干燥方法,鼓风干燥操作简单,可显著降低成本,同时能达到预期的干燥效果[3]。有研究发现,糖作为干燥保护剂能起到脱水保护的作用,并且不含原基,不会使蛋白质发生褐变反应从而变质失活,甘油可以清除自由基及活性氧,这有助于防止变性和其他形式的损坏[4]。

本研究以运动发酵单胞菌为研究对象,采用固态培养基培养运动发酵单胞菌,使用显微镜计数法统计细菌数量,利用鼓风干燥法处理细菌,通过添加可能的保护剂分析其对细菌存活率的影响,最后采用发酵方式分析鼓风干燥运动发酵单胞菌的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

运动发酵单胞菌由湖北工业大学汪浩勇老师实验室提供。

1.1.2 原料

豆粕和麸皮均购自河北油脂有限公司,含水率分别为11.3%和11.8%。

1.1.3 培养基

固态培养基:豆粕7 g,麸皮3 g,混合后121 ℃灭菌20 min。

ZM 液态培养基:25%葡萄糖,1%酵母提取物,0.1%七水硫酸镁,0.1%磷酸氢二钾,0.1%硫酸铵,pH 6.0~7.0,115 ℃灭菌30 min。

ZM 活化培养基:10%葡萄糖,1%酵母提取物,0.1%七水硫酸镁,0.1%磷酸氢二钾,0.1%硫酸铵,pH 6.0~7.0,115 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

SPX-250-B 型生化培养箱,上海福码公司;LS-335L-I 型高压蒸汽灭菌锅,江阴宾江医疗有限公司;PH50-3A43L 型显微镜,苏州光学神鹰有限公司;101-2B 型电热鼓风干燥箱,恒诺利兴科技有限公司;DHS-10A 型电子水分测定仪,邦西仪器科技有限公司;CJ-2D 型超净工作台,天津泰斯特。

1.3 试验方法

1.3.1 运动发酵单胞菌的固态培养

使用豆粕作为原料提供细菌生长所需的营养,麸皮作为辅料改善培养基的通透性。豆粕与麸皮质量比为7∶3 的混合原料10 g,5%的活化菌液混在无菌水溶液(含有0.1%七水硫酸镁,0.1%磷酸氢二钾,0.1%硫酸铵,5%葡萄糖)中,取10 g 加到混合原料中混匀,在33 ℃恒温培养箱中培养24 h,使用显微镜观察并统计细菌数。

1.3.2 鼓风干燥及保护剂添加

分别用灭菌的淀粉、乳糖和麦芽糖与培养的运动发酵单胞菌固态培养基等质量混合。固态培养基和保护剂各称取4 g(培养基是湿重,含有50.39%的水分),混匀后放在39 ℃电热鼓风干燥箱风吹,直至含水率低于10%。

1.3.3 组合保护剂的选择

培养运动发酵单胞菌的固态培养基与乳糖等质量混匀后,分别添加固态培养基质量分数2%,4%,6%,8%的甘油到其中,另一组分别添加固态培养基质量分数5%,10%,15%,20%的甘露糖,混匀后放在39 ℃电热鼓风干燥箱风吹,直至含水率低于10%。

1.3.4 发酵试验

经过鼓风干燥的菌株用无菌水悬浮起来,以5%的接种量加入葡萄糖发酵培养基,瓶口用活塞塞紧,并添加石蜡油密封,第一次称重并记录,发酵瓶置于恒温摇床中超过72 h。结束后进行第二次称重。

1.3.5 细菌总数及活菌数的确定

运动发酵单胞菌培养结束后,加水约45 g 将细菌悬浮起来,取50 μL 悬液,将其加到有950 μL 无菌水的EP 管中混匀,取10 μL 于血球计数板,用显微镜拍照计数。

鼓风干燥结束后,加入大约45 g 水将细菌悬浮起来,混匀后取10 μL 加到含有30 μL 水的八连管中,取10 μL 亚甲基蓝溶液加入其中进行染色,染色时间大约1 min,取10 μL 染色液于血球计数板上,用显微镜拍照统计细菌总数和活细菌数。其中在显微镜下观察到蓝色的细菌为死细菌,颜色没有变化的是活细菌。细菌数/g=N×256×5 000×稀释倍数(N 为显微镜下观察到的细菌数)

2 结果与分析

2.1 运动发酵单胞菌固态培养

以豆粕7 g 和麸皮3 g 混合作为固态培养基,5%的运动发酵单胞菌与无菌水(含有0.1%七水硫酸镁,0.1%磷酸氢二钾,0.1%硫酸铵,5%葡萄糖)混匀后取10 g 加入固态培养基中,在33 ℃下培养24 h。在显微镜下观察到的形态如图1 所示,运动发酵单胞菌在显微镜下呈圆形、无色透明状态,经统计计算得出细菌数达到1.85×1010CFU/g。表明在此条件下能够培养出足够多的细菌。

图1 运动发酵单胞菌显微镜下的形态

2.2 鼓风干燥的主要保护剂选择

运动发酵单胞菌培养24 h 后,淀粉、麦芽糖、乳糖作为保护剂与培养细菌的固态培养基1∶1 混匀,以不添加任何保护剂的培养基作为对照组,然后放在39 ℃电热鼓风干燥箱中风吹干燥,直到含水量低于10%。麦芽糖和乳糖经过稀释后,可以在显微镜下清楚地观察到细菌,可以作为保护剂与固态培养基1∶1 混匀进行鼓风干燥。麦芽糖和乳糖作为保护剂进行热风干燥后,细菌总数和活菌数分别为1.38×1010CFU/g、7.27×109CFU/g,1.05×1010CFU/g、9.07×109CFU/g。其对应的存活率分别为52.49%和86.34%。对照组总细菌数为7.35×109CFU/g,活菌数只有2.79×109CFU/g,存活率为37.91%。虽然添加麦芽糖后,细菌总数达到最高,但其保护效果不明显,而添加乳糖后,存活率明显比对照组和添加麦芽糖的高,且细菌总数也比对照组有明显增加。因此,选择乳糖作为鼓风干燥的主要保护剂。

2.3 组合保护剂选择

固态培养基等质量的乳糖分别与5%,10%,15%,20%的甘露糖为组合保护剂。当添加5%的甘露糖后,细菌总数达到1.26×1010CFU/g,活菌数也高达1.19×1010CFU/g,细菌数显著比对照组多,其存活率超过94%。进一步增加其添加量,细菌总数明显减少。表明在鼓风干燥过程中,添加5%的甘露糖能有效地增加细菌数,提高细菌存活率。

固态培养基等质量的乳糖分别与2%,4%,6%,8%的甘油作为组合保护剂。添加2%和4%的甘油后进行鼓风干燥,细菌总数分别达到1.38×1010CFU/g 和1.26×1010CFU/g,而活菌数也分别高达1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g,细菌总数明显比对照组多,存活率超过94%。在鼓风干燥过程中,添加一定量的甘油能有效地使细菌从固形物中脱离下来,从而能在显微镜中观察到更多的细菌。当甘油的添加量增加时,细菌数有所减少,过多的甘油添加量也会减少细菌数量。鼓风干燥过程中,2%~4%的甘油添加不仅能有效地提高细菌总数,还能提高细菌干燥存活率。

2.4 发酵试验

鼓风干燥结束后,用无菌水将运动发酵单胞菌悬浮起来,吸取1 mL 接种于25%的葡萄糖发酵培养基中,培养基质量为30 g,用电子天平称整个发酵瓶的质量,在34 ℃下培养72 h,结束后再称其质量,计算其失重。结果如表1 所示,干燥后的失重值为0.100 1 g/g,与没有干燥菌株的失重结果非常接近,表明鼓风干燥方式可用于运动发酵单胞菌的干燥。

表1 发酵失重结果(单位:g)

3 结论

在5%接菌量、5%葡萄糖浓添加量、加水量10 g、33 ℃条件下培养时间24 h,获得的细菌数为1.85×1010CFU/g。在39 ℃下进行鼓风干燥,固态培养基等质量的乳糖与5%的甘露糖作为组合保护剂,活菌数达到1.19×1010CFU/g,存活率超过94%,对鼓风干燥有明显的保护效果。固态培养基等质量的乳糖分别与2%或4%的甘油作为组合保护剂,活菌数分别达到1.31×1010CFU/g 和1.2×1010CFU/g,存活率超过94%。干燥前后的菌株都具有较好的发酵能力。

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