基于拟靶向胆汁酸代谢组学筛选柴胡抗抑郁的活性部位

高芳荣 ，王威宇 ，罗培琰，李 静 ，秦雪梅 ，高晓霞 *

1. 山西大学 中医药现代研究中心，山西 太原 030006

2. 山西大学 化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西 太原 030006

3. 山西大学化学化工学院，山西 太原 030006

柴胡BupleuriRadix为伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC. 或 狭 叶 柴 胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，辛、苦、微寒，主入肝胆，疏达经气，宣通内外，发挥枢利脏腑气血、和解少阳的功效[1-2]。临床研究表明以其为君药的复方如逍遥散、大柴胡汤等，常用于治疗胆汁淤积的肝病和并发抑郁等疾病[3-4]，文献报道中药名方柴胡疏肝散通过调节磷脂和胆汁酸代谢缓解慢性不可预知应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）诱导的肝损伤，从而发挥抗抑郁作用[5-8]。课题组前期研究发现，柴胡低极性部位有多炔类RB2、RB4 等代表性活性成分[9-10]，并对CUMS 模型大鼠肝组织进行转录组学研究发现，柴胡低极性部位的抗抑郁作用与胆汁酸代谢密切相关[11]，抑郁症发病机制涉及多重因素，但具体机制尚未完全阐明。而近年来研究发现，抑郁症的发病与胆汁酸的平衡发生紊乱密切相关。研究表明抑郁症存在胆汁酸代谢障碍[12-17]。

胆汁酸是胆汁中发现的一大类胆烷酸总称，作为胆汁的主要组成成分，常以钠或钾的胆盐形式存在[18]。现代研究表明胆汁酸是治疗胆汁淤积性疾病的重要靶点，胆汁酸稳态失衡可导致胆汁酸过度积累，引发肝脏炎症和损伤[19-20]。大量研究发现贯穿脑-肝-肠代谢轴的胆汁酸转运和代谢出现紊乱很可能是肝性脑病重要的发病机制[21-22]。胆汁酸及其受体在抑郁症的发病机制中获得广泛关注。但由于种类众多，不易全面定量分析。拟靶向代谢组学技术是许国旺团队于2012 年首次提出的概念[23]，是一种定量离子选择算法，用于对所有检测到的代谢物进行定量离子选择，通过保留时间锁定质谱选择离子监测方式，样品中的已知和未知代谢物都可以被测量，该方法结合了非靶向和靶向代谢组学的优点，且不需要所有标样来限定检测的代谢物。由于抑郁症的发生发展与机体的代谢状态密切相关，因此将拟靶向代谢组学研究用于检测胆汁酸谱的全面变化可以更好地研究疾病的发展。

本研究采用柴胡不同极性部位对CUMS 抑郁大鼠模型进行实验，通过监测行为学指标和分析血清神经递质水平的变化，以筛选出最佳药效部位。通过测定肝功能指标和总胆汁酸（total bile acid，TBA）水平，表明柴胡低极性部位可发挥肝保护作用，同时调节总胆汁酸水平。采用UPLC-MS/MS 拟靶向代谢组学建立测定胆汁酸的方法，能够测定大鼠盲肠内容物胆汁酸种类和相对含量，为临床探究胆汁酸谱的具体变化提供方法，同时对柴胡通过胆汁酸代谢抗抑郁的机制研究提供依据。

1 材料

1.1 动物

SPF 级成年雄性SD 大鼠54 只，体质量（180±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2012-0001。动物饲养于清洁环境，温度（23±2）℃，相对湿度（45±10）%，自由进食饮水，12 h 光照/黑暗周期。动物实验均通过山西大学科学研究伦理审查委员会审查（批准号SXULL2019005）。

1.2 药材

柴胡饮片（批号1805215131）购自安国市吉腾达药材有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为伞形科植物柴胡B.chinenseDC.的干燥根或根茎，符合《中国药典》2020 年版规定，留样于山西大学中医药现代研究中心。

1.3 药品与试剂

盐酸文拉法辛胶囊（批号171203）购自成都康弘药业集团股份有限公司；内标3,4-二羟基苄胺·氢溴酸（3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide，DHBA，批号MKBS7646V）购自美国Sigma 公司；95%乙醇、石油醚、醋酸乙酯均为分析纯，购自北京化工试剂公司；蔗糖、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯-80 购自北京化学工业集团有限责任公司；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，质谱级甲酸购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；对照品胆酸（cholic acid，CA，质量分数≥97%，批号201-337-8）、去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA，批号201-478-5）、鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid，CDCA，批号207-481-8）、猪去氧胆酸（hyodeoxycholic acid，HDCA ， 批号 203-358-6 ）、 熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，批号204-879-3）、牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA，批号 204-695-4）、牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA，批号207-457-6）、牛磺胆酸（taurocholic acid，TCA，批号205-653-7）均购自上海源叶生物科技有限公司，以上对照品质量分数均≥98% ； 18β- 甘草次酸（ 18βglycyrrhetinic acid，18β-GA，质量分数≥98%）购自四川永健医药有限公司；TBA ELISA 试剂盒（批号20160910）购自南京建成生物工程研究所。

1.4 仪器

1290 II 型超高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；3200Q-TRAP 型三重四极杆串联质谱仪（美国AB Sciex 公司）；UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 超高效液相色谱质谱联用仪及Xcalibur 工作站；Neofuge13R 型高速冷冻离心机（力康公司）；MX-S型可调式混匀仪（美国Scilogex 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；Legend Micro17R 型高速低温离心机；PRIME60i 型全自动生化仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；旋转蒸发仪（德国艾卡公司）；DHFSTPRP-24 型高通量组织研磨仪（宁波洛尚智能科技有限公司）；大鼠旷场实验测试箱（自制的无顶长方盒，长100 cm、宽100 cm、高70 cm，盒中四壁及底面涂黑，底部白线划分成25 个边长20 cm 的正方形格）。

2 方法

2.1 柴胡不同部位的提取

称取柴胡饮片适量，用8 倍量95%乙醇浸泡12 h，回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，滤过，回收溶剂至干，加水分散，混悬液用等体积的石油醚萃取至无色，将上层萃取液回收溶剂至干即得柴胡石油醚低极性部位（出膏率1.6%）；下层混悬液用等体积的醋酸乙酯萃取至无色，将上层萃取液回收溶剂至干，即得柴胡醋酸乙酯中极性部位（出膏率1.98%）。将药渣用8 倍量的水回流提取2 次，每次2 h，合并提取液与醋酸乙酯萃取后的下层混悬液，回收溶剂，得到柴胡水提物高极性部位（出膏率17.8%）。

2.2 分组、造模及给药

54 只SD 大鼠适应性喂养7 d 后，根据体质量、糖水偏爱率、旷场实验的基线结果，随机分为对照组、模型组、盐酸文拉法辛（35 mg/kg）组、柴胡低极性部位（15 g/kg）组、柴胡中极性部位（15 g/kg）和柴胡高极性部位（15 g/kg）组，每组9 只。使用课题组前期CUMS 模型复制方法[24]，均采用单笼饲养，连续28 d，大鼠每日给药后1 h 给予刺激，且每种刺激的实施随机不连续。刺激包括禁水，禁食24 h，夹尾刺激2 min，超声刺激3 h，束缚3 h，50 ℃热刺激5 min，电击刺激（36 V、10 次），昼夜颠倒12 h，4 ℃游泳5 min。对照组大鼠正常饲养，每笼9 只，且不给予任何刺激。造模同时各给药组ig 相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积溶剂（0.5%羧甲基纤维素钠-0.5%聚山梨酯80 水溶液），1 次/d，连续28 d。

2.3 生物样本收集

给药结束后，通过股动脉取血的方式采集血液，置于EP 管中，静置30 min 后4 ℃、3 500 r/min 离心10 min，分离血清并分装；同时收集新鲜的盲肠内容物，放入液氮快速冷冻后储存于-80 ℃冰箱中保存备用。

2.4 抑郁症大鼠行为学评价

参照文献报道方法[25]，通过大鼠的体质量变化、糖水偏好实验、旷场实验（水平穿越格数和直立次数）的测定数据，观察大鼠28 d 内行为学变化。

2.5 血清中9 种神经递质含量的测定

采用课题组前期建立的LC-MS 法[26]，同时测定血清中的色氨酸（tryptophane，Trp）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）、多巴胺（dopamine，DA）、乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）、γ-氨基丁酸（γaminobutyricacid，GABA）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、酪氨酸（tyrosine，Tyr）9 种单胺类神经递质的含量。

2.6 生化指标的测定

采用全自动生化分析仪测定γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和血清总胆红素（serum bilirubin，TBIL）含量。

2.7 盲肠内容物TBA 水平的测定

按照ELISA 试剂盒说明书测定各组大鼠TBA水平。

2.8 UPLC-MS 测定盲肠内容物胆汁酸谱

2.8.1 对照品溶液的制备 分别称取8 种胆汁酸（CA、DCA、CDCA、HDCA、UDCA、TUDCA、

TCDCA、TCA）对照品适量，结合型的水溶性胆汁酸对照品用超纯水溶解，其他胆汁酸对照品以甲醇为溶剂溶解，均配成1.0 mmol/L 的对照品储备液，置于-80 ℃的超低温冰箱中储藏备用，用于盲肠内容物胆汁酸检测的辅助鉴定。内标18β-GA 以甲醇为溶剂，配成1.0 mmol/L 的对照品储备液备用。

2.8.2 样品制备 从-80 ℃冰箱取出盲肠内容物样本，于4 ℃下解冻，精密称定500 mg 置于5 mL EP 管，加入含内标的乙腈3 mL，涡旋2 min，4 ℃、13 000 r/min 离心15 min，取上清，取50 μL 进样分析。分别取样本10 μL 混合作为质控样本。取8 种胆汁酸对照品均稀释1 μmol/L，分别取50 μL 进样分析。

2.8.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱：0～2 min，2% B；2～3 min，2%～35% B；3～17 min，35%～70% B；17～18 min，70% B；18～29 min，70%～98% B；29～31 min，98% B；31～33 min，98%～2% B。体积流量0.3 mL/min；柱温45 ℃；进样量5 μL。

2.8.4 质谱条件 选择FullScan 扫描模式，正、负离子切换同时扫描及Target 扫描模式，使用Xcalibur 3.0 软件对样品进行一级质谱数据采集，仪器参数为ESI 源，喷雾电压＋3.0 kV；喷雾电压-2.7 kV；毛细管温度320 ℃；加热器温度300 ℃；鞘气压力3 546.38 kPa；辅助气压力1 013.25 kPa；分辨率70 000；分辨率（dd-MS2）17 500，归一化碰撞能量为12.5、25.0、37.5 eV；扫描范围m/z50～1 200。

2.9 统计学分析

实验数据使用SPSS statistics 16.0、Graphpad Prism 7.0、Excel 2016 等软件处理。结果以±s表示。针对两组数据间差异性比较采用SPSS 16.0 软件进行t检验，作图软件为GraphPad Prism 7.0。

3 结果

3.1 柴胡抗抑郁最佳部位筛选

3.1.1 柴胡不同极性部位对CUMS 大鼠行为学指标的影响 如图1 所示，与对照组比较，模型组大鼠的基础生存状态下降，活跃程度及对四周环境的好奇心降低、快感缺失，提示抑郁模型复制成功。在实验开始时，各组大鼠体质量、糖水偏爱率、穿越格数、直立次数均无显著差异。造模21、28 d，与对照组比较，模型组大鼠体质量显著降低（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，造模28 d 各给药组大鼠体质量均升高。造模21、28 d，与对照组比较，模型组大鼠糖水偏爱率显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠糖水偏爱率显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。造模7、21、28 d，与对照组比较，模型组大鼠水平穿越格数显著降低（P＜0.05、0.001）；与模型组比较，造模14 d 柴胡高极性部位组大鼠水平穿越格数显著升高（P＜0.05），造模28 d 盐酸文拉法辛组、柴胡低极性部位组和柴胡中极性部位组大鼠水平穿越格数显著升高（P＜0.05、0.01）。造模7、14、21、28 d，与对照组比较，模型组大鼠直立次数显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，造模28 d 各给药组大鼠直立次数均显著升高（P＜0.05、0.01）。

图1 柴胡不同极性部位对CUMS 大鼠体质量、糖水偏爱率、穿越格数和直立次数的影响 (±s, n = 9)Fig.1 Effects of different polar parts of Bupleuri Radix on body weight, sucrose preference rate, number of crossing grids and rearing times in CUMS rats (±s, n = 9)

以上结果表明柴胡不同极性部位可提高CUMS模型大鼠的活动能力以及对新奇事物的探索能力，体质量和糖水偏爱率显著回调，但其中柴胡低极性部位效果最好。

3.1.2 柴胡不同极性部位对CUMS 大鼠血清中神经递质含量的影响 如图2 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中Trp、5-HT、GABA、Tyr 的含量明显下降（P＜0.05、0.01），5-HIAA、Glu、ACH、DA、NE 的含量也有所下降，但差异无统计学意义。与模型组比较，经不同极性部位给药处理后，柴胡中极性部位组的Trp、GABA、Glu、ACH、Tyr、NE水平明显升高（P＜0.01、0.001），DA 水平升高但无统计学差异；柴胡高极性部位组的Trp、5-HT、5-HIAA、GABA、ACH、Tyr、DA 和NE 水平明显升高（P＜0.01、0.001）；盐酸文拉法辛组Trp、GABA、Tyr 和NE 水平显著升高（P＜0.05、0.01），5-HT 水平升高，但差异无统计学意义；柴胡低极性部位组的Trp、5-HT、GABA、Tyr、和NE 的水平明显升高（P＜0.01、0.001），DA 水平升高，且与对照组相比更接近。

图2 柴胡不同极性部位对CUMS 大鼠血清中神经递质含量的影响 (±s, n = 9)Fig.2 Effects of different polar parts of Bupleuri Radix on contents of neurotransmitters in serum of CUMS rats(±s, n = 9)

不同极性组分的联合应用可能会对多个靶点的作用起到一定的表征作用，而柴胡低极性部位可能具有最佳的抗抑郁效果。因此，被用于进一步研究。

3.2 柴胡低极性部位改善抑郁大鼠肝功能指标

如图3 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中γ-GT 活性显著升高（P＜0.05），TBIL 含量呈升高趋势，提示模型大鼠的肝功能异常，存在轻微的肝损伤。给予柴胡低极性部位后，大鼠血清中γ-GT活性和TBIL 含量均显著降低（P＜0.05），ALP 活性有回调趋势，表明柴胡低极性部位可改善抑郁大鼠肝功能。

图3 柴胡低极性部位对CUMS 大鼠血清中γ-GT、ALP 活性和TBIL 的含量的影响 (±s, n = 8)Fig.3 Effect of low polarity part of Bupleuri Radix on activities of γ-GT, ALP and content of TBIL in serum of CUMS rats(±s, n = 8)

3.3 柴胡低极性部位对CUMS 大鼠盲肠内容物TBA 水平的影响

如图4 所示，与对照组比较，模型组大鼠盲肠中TBA 水平显著降低（P＜0.01），提示抑郁模型胆汁酸代谢存在障碍。给予柴胡低极性部位后，大鼠盲肠中TBA 含量显著回调（P＜0.01），表明柴胡低极性部位可以缓解抑郁模型导致的TBA 水平紊乱，其发挥抗抑郁作用可能与调节胆汁酸的代谢有关。

图4 柴胡低极性部位对CUMS 大鼠盲肠内容物TBA 水平的影响 (±s, n = 8)Fig.4 Effect of low polarity part of Bupleuri Radix on TBA level in CUMS rats (±s, n = 8)

3.4 胆汁酸谱测定方法建立

3.4.1 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 仪器系统稳定性监测结果 每个质控样本分别提取的36 个提取离子的tR的RSD 均在0.5%以下，m/z的RSD 在4.02×10-7以内，相对峰面积的RSD 均小于16%，表明仪器稳定性较好，建立的UPLC-MS 测定的代谢组数据稳定可靠，满足后续代谢组分析的要求。

3.4.2 质谱色谱专属性试验 在本实验条件下，所有胆汁酸有较大的质谱峰和较好的分离度，经处理的盲肠内容物中其他杂质不干扰样品的分离测定。图5 为不同通道下36 种胆汁酸加内标液色谱图。初级的胆汁酸类多为鼠胆酸和异构胆酸编号CA-1～CA-3，脱氧胆酸类未知的为D-1～D-3，石胆酸类未知的编号为L-1，牛磺脱氧胆酸类标号为TD-1，甘氨脱氧胆酸类GD-1，甘氨胆酸类G-1～G-4，共包括8 个离子通道的17 种非结合型胆汁酸和19种结合型胆汁酸。

图5 大鼠盲肠内容物36 种胆汁酸及内标提取离子流图Fig.5 Extracted ion chromatogram of 36 bile acids and internal standard in cecal contents of rats

3.5 盲肠内容物中差异胆汁酸分析

采用拟靶向代谢组的方法对对照组、模型组和柴胡低极性部位组大鼠盲肠内容物中的胆汁酸进行研究，如图6 所示，共检测到36 种胆汁酸，总体趋势与TCA 结果一致。模型组胆酸类α-MCA、ω-MCA、CA-2、CA、CA-3 含量均显著下降（P＜0.05），给药后CA 含量显著回调，α-MCA、CA-3 呈回调趋势；模型组脱氧胆酸类UDCA、D-3、CDCA 的含量显著下降，给药后UDCA 显著上调，其他有上调趋势：模型组牛磺结合型胆汁酸均显著下降，给药后TLCA、TUDCA、TCDCA、TDCA 的含量显著回调；模型组GLCA、GCA 等甘氨类胆酸都有下降趋势，给药后显回调趋势，但无显著性差异。

图6 大鼠盲肠内容物的胆汁酸谱结果 (±s, n = 9)Fig.6 Results of bile acid spectrum of cecal contents in rats (±s, n = 9)

将鉴定出来的36 种胆汁酸类型按照分组进行主成分分析（principal component analysis，PCA）见图7-A，结果显示不同组之间有明显的聚类和分离趋势。随后将测定出来的36 种胆汁酸按照模型组和给药组进行正交偏最小二乘法-判别分析（ orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）见图7-B，可见两者具有一定分离趋势，进一步设置变量重要性投影（variable importance projection，VIP）≥1 和t检验（P＜0.05）进行差异代谢物的筛选，筛选出2 组的5 种差异胆汁酸（TUDCA、UDCA、TDCA、TCDCA、TLCA），表明柴胡低极性部位主要通过回调这5 种差异胆汁酸的含量来发挥抗抑郁作用。

图7 各组胆汁酸类型PCA 得分图 (A)、模型组和柴胡低极性部位组OPLS-DA 得分图 (B)Fig.7 PCA score map of bile acid types in each group (A), OPLS-DA score map in model group and low polarity part of Bupleuri Radix group (B)

4 讨论

神经递质假说是普遍公认的抑郁症发病机制，认为抑郁症与神经突触间隙单胺类递质水平减少有关[27]。研究表明，体内神经突触间隙NE、5-HT 或DA 相对或绝对不足是引起抑郁症发生的重要原因，且5-HT 水平受其合成前体Trp 和其代谢物5-HIAA 含量的影响[28]，模型组Trp、5-HT 含量降低，柴胡低极性部位组可回调Trp、5-HT、5-HIAA 水平，调控5-HT 的代谢途径。研究发现应激性生活事件使Glu 浓度升高，GABA 浓度降低，引起Glu 能系统过度激活，而GABA 神经传递活动减退，Glu 和GABA 的平衡失调导致抑郁等情感障碍疾病的发生[29]。模型组GABA、GABA/Glu 含量降低，给药后柴胡低极性部位组可显著升高GABA 的水平，调节氨基酸神经递质比例的平衡。

本研究中模型组血清γ-GT 活性和TBIL 含量均有不同程度的升高，表明CUMS 大鼠肝细胞可能存在一定程度的损伤，与许多文献报道一致[30-31]。而ALP 的下调趋势与肝细胞损伤的结果相反，临床上ALP 活性下降见于贫血或者营养不良，推测可能与抑郁大鼠饮食量降低造成的营养不良有关。而临床研究报道，肝功能指标γ-GT、TBIL、ALP 均可在疾病的不同严重程度检测到升高，但是ALP 的升高呈不规则性，个体差异较大[27]，这也可能是本研究ALP 活性下降的另一个原因。给予柴胡低极性部位干预后，生化指标均有不同程度的回调，说明柴胡低极性部位具有肝保护作用。

通过对盲肠内容物的TBA 水平进行检测，发现TBA 发生了显著变化，而TBA 水平改变说明整个胆汁酸循环代谢出现障碍。给药后盲肠内容物总胆汁酸水平显著回调，提示柴胡低极性部位可能促进胆汁排泄、调节胆汁酸代谢、合成等途径改善抑郁症。拟靶向代谢组学研究发现，柴胡低极性部位给药后，体内胆汁酸代谢发生了变化。文献研究表明，重度抑郁障碍患者TLCA 显著下降[32]，这与本研究结果一致。研究发现，UDCA 可通过改变胆汁酸池，抑制小肠吸收毒性胆汁酸等，从而发挥肝保护作用[33-34]，最近许多研究报道也发现UDCA 具有神经保护作用[35-36]。因此UDCA 的下调可能是疾病发生的关键因素。已有研究表明TUDCA 可以发挥抗抑郁样作用[37]。柴胡疏肝散抗抑郁作用研究中发现CUMS 大鼠肝组织中TUDCA 水平显著下降，与本实验结果一致[38]。提示UDCA 与TUDCA 水平的降低可能与疾病的发生密切相关，表明柴胡低极性部位可能通过调节胆汁酸谱从而治疗抑郁症，具体代谢通路和机制仍需继续验证。此外，课题组前期鉴定了柴胡低极性部位的入血成分，具有代表性的10种活性成分为柴胡皂苷元A、柴胡皂苷元G、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、槲皮素、异鼠李素、多炔类RB2、RB4、RB6、RB9[9-10]。

综上，本研究筛选出柴胡低极性部位为最佳抗抑郁部位，具有较好的抗抑郁作用和保肝作用。同时具有调节胆汁酸谱的作用，基于UPLC-MS 建立了拟靶向代谢组学测定方法，可同时测定36 种胆汁酸的相对含量，能够用于大鼠胆汁酸谱的测定。该方法前处理操作方便快捷，灵敏度和特异性较高，对某些疾病的早期无创诊断和深入的研究具有重要意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突