基于矿物元素指纹图谱鉴定陈皮产地的方法研究

赖晓娜，罗辉泰，张春华，黄锦沛，陈怡珊，李 乐，周 熙，黄 芳，吴惠勤*

（1.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070；2.江门市新会区动物防疫监督所（江门市新会区农产品质量安全监督检验测试中心），广东 江门 529199）

陈皮（Citrus reticulata blanco），又名橘皮，由芸香科植物橘成熟后的果皮干燥制得，有开气行痰、止呕止咳、健脾和胃的功效。主要产地为广东、四川、湖南等。陈皮分为新会陈皮及其他陈皮，其中以新会陈皮质量最优，价格最高，是第一批被列入《广东省岭南中药材保护条例》的岭南中药材。目前市场上存在不良商家以其他陈皮冒充新会陈皮、以假乱真的现象。因此，建立一种快速鉴别陈皮产地的方法十分必要。

陈皮的产地鉴别目前主要使用高效液相色谱指纹图谱［1］、气相色谱-质谱联用［2］、成分含量差异研究［3］、红外光谱［4］、次生代谢产物研究［5］等方法。这些方法大多仅能筛选得到少数几个有效差异指标，无法全面反映不同产地差异。同时有机成分在加工、贮藏中极易变化、损失，造成溯源效果不佳。

植物生长过程中通过根茎吸取土壤中的矿物元素，某一产区植物中的矿物元素与其产地的土壤矿物元素存在极强的相关性［6］，因此带有地域特征的矿物元素含量和种类是植物产地溯源的重要指标。矿物元素作为常用的溯源指标之一，已广泛应用于松江大米［7］、黑龙江黄豆［8］、银耳［9］、生姜［10］的产地鉴别中。李富荣等［11］利用陈皮矿物元素含量结合多元统计分析构建了陈皮产地的判别模型，彭政等［12］构建了基于矿物元素的神经网络模型进行陈皮产地判定。以上两种方法均采用了数据深度分析的化学计量法，不利于推广使用。矿物元素指纹图谱通过将数字转化为图形，简化了分析步骤，实现了数据的可视化，已用于西洋参［13］、茶叶［14］的产地研究。

本研究以新会、广西、湖南3个不同产地的陈皮样品为对象，对陈皮中的51种矿物元素进行分析，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定陈皮中的矿物元素含量，并通过元素分类和缩放系数计算，建立了不同产地陈皮中矿物元素的指纹图谱。通过构建标准指纹图谱并进行相似度分析，建立了陈皮产地的鉴别模型。所建立的模型可对新会陈皮和其他陈皮进行鉴别，为陈皮产地溯源提供了技术支撑，并为政府部门、市场监督提供了有效方法。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

42批陈皮样品，其中包括新会陈皮24批（XH-1~XH-18用于训练集，XH-19~XH-24用于验证集），湖南陈皮9 批（HN-1~HN-9），广西陈皮9 批（GX-1~GX-9）。所有陈皮样品均于60 ℃烘干2 h，粉碎过筛后装入密封袋于干燥塔中保存。

P 单元素标准溶液（1 000 μg/mL），Ca、K、Mg、Na 元素标准溶液（1 000 μg/mL）（北京坛墨质检科技有限公司）；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn 元素标准溶液（100 μg/mL），La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y 元素标准溶液（100 μg/mL）（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn 元素标准溶液（100 μg/mL，安捷伦科技有限公司）；Sc、Mo、Hg、Rh、Re 元素标准溶液（1 000 μg/mL，国家钢铁材料测试中心）；UP级HNO3（68%，苏州晶瑞化学股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

Agilent 7700x ICP-MS 电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦公司），G-160微波消解仪，WX-8000赶酸器（上海屹尧仪器科技发展有限公司），TP-214丹佛电子天平（美国丹佛仪器公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品消解陈皮样品经粉碎后精密称量约0.5 g于聚四氟乙烯消解管中，准确加入浓硝酸5 mL并静置30 min，随后于200 ℃微波消解仪中消解25 min，冷却后取出消解管，于120 ℃赶酸约20 min，定量转移消解液至25 mL具塞比色管中，超纯水定容。取消解液5 mL至100 mL具塞比色管中，用超纯水定容，用于常量元素的含量测定。按上述步骤制作试剂空白。

1.3.2 ICP-MS 工作条件射频功率：1 550 W；采样深度：8 mm；雾化器：MicroMist；雾化室温度：2 ℃；等离子体气（氩气）：15.0 L/min，辅助气（氩气）：0.8 L/min，载气（氩气）：1.03 L/min，碰撞气（氦气）：4.3 mL/min（碰撞模式）。内标元素Rh和Re通过T型三通管在线引入等离子体，蠕动泵转速为0.1 r/s。

1.3.3 元素指纹图谱建立采用ICP-MS 测定陈皮元素含量，并使用SIMCA 进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），以SPSS20.0 进行方差分析，筛选有明显差异的元素作为溯源指标，同时对不同数量级含量进行系数缩放。使用origin 2019b软件作图，将元素按VIP值（Variable important for the projection）由大到小排序，以测定元素为横坐标，相对含量为纵坐标，构建各样品的矿物元素-含量关系图，并以各元素含量的均值建立各地陈皮的标准指纹图谱。

1.3.4 相似度评价利用SPSS 22.0软件分析指纹图谱的相似度，选择夹角余弦距离进行分析。计算原理如下：

式中，x为法向量，|x| 为向量的模，cosθ表示向量x与向量y之间的夹角，其值越接近1 说明两个向量越相似。

1.3.5 产地鉴别相似度阈值设定为某地指纹图谱与标准指纹图谱相似度的最小值，鉴别未知产地陈皮时，计算其与矿物元素标准指纹图谱的相似度，相似度高于阈值，则判定属于某地。

2 结果与讨论

2.1 不同产地陈皮的矿物元素含量差异分析

土壤中矿物元素的种类和含量具有特征性，植物中的矿物元素需要通过外界吸收并在生长过程中不断积累［15］。土壤是植物吸收、积累、转移元素的最直接来源，“基岩-土壤-植物系统”为特色农产品的元素迁聚规律提供了科学支撑，元素在系统内的迁移特征也揭示了特色农产品与地球化学特征的内在联系，探寻植物内元素的地域特征以溯源道地药材或农产品的方法被证明具有广泛应用价值［16］。新会地处冲积平原带，汇聚西江、潭江，处于咸淡水交界，有研究指出，新会汇聚了大量随沉积物迁徙的重金属元素和营养元素，有大量元素高背景的特征［17］。

新会、湖南和广西3个产地陈皮中矿物元素的平均含量及标准偏差（SD）结果见表1。除少数微量元素如Sn、Hg、Bi在新会样品中未检出外，其余元素在3 地陈皮中均被检测到，实际纳入统计的矿物元素共48种。

表1 不同产地陈皮样品中矿物元素的含量Table 1 Mineral element content in citrus reticulata blanco samples from different regions

生命必需元素有29种，按体内含量的高低又分为常量元素和微量元素。常量元素有C、H、O、N、P、S、Cl、K、Ca、Na、Mg 11种由表1可知，实验测定的5种常量元素（P、K、Ca、Na、Mg）中，K含量最高，为9.5~13.7 g/kg。其中，新会陈皮中K 含量最高，广西和湖南次之，且三地陈皮中的K 含量差异显著。

微量元素指占生物体总质量小于0.01%的元素共有18种。但由于实验购置的标准溶液不全，仅测定15 种微量元素，微量元素（Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Cr、Se、Ni、Mo、V、Sn、Sr、B、Rb、As）的含量测定结果显示，Fe 元素含量占第一位，为52.1~90.3 mg/kg，Mn、Cu、Zn 元素的含量也达到 mg/kg级，且新会陈皮中Cu的含量远高于其他两地，但新会陈皮中Se、Mo的含量仅为30 μg/kg。

稀土元素（Ce、La、Nd、Y、Pr、Gd、Sc、Sm、Dy、Er、Eu、Yb、Tb、Ho、Tm、Lu）的含量测定结果显示，各地陈皮中稀土元素的含量均低于mg/kg 级别，其中，Ce、La、Nd 元素的含量依次降低。虽然新会陈皮中这3种元素的含量均高于其他两地，但其间不具有显著差异。

重金属及有害元素（Cu、Pb、As、Cd、Hg）的含量测定结果显示，新会陈皮中Cd 元素含量高达20.71 μg/kg，与广西及湖南陈皮（含量＜10 μg/kg）间呈显著差异，其余重金属元素含量则差别不大。

对于其他元素，3 地陈皮中Ba、Ga 的含量均较高，达到 mg/kg 级别，且具有显著性差异。新会陈皮中的Ba、Ga元素含量远低于广西和湖南陈皮。

上述结果表明，新会陈皮的矿物元素分布特征与新会土壤部分重金属及有益元素呈强度富集的土壤元素分布特征基本协同［17］。

各产地陈皮对土壤中矿物元素的吸收富集程度不同，其矿物元素含量及组成具有区域性特征。为进一步分析各产地特征在陈皮产地判别中的意义与价值，通过SIMCA软件建立了不同产地陈皮的PLSDA 分类模型，对产地差异进行可视化趋势分析。如图1 所示，该模型将陈皮明显分为3 类，不同产地表现出各自的分布趋势，且拟合程度良好（R2Y=0.88，Q2=0.756），说明各产地陈皮样品间差异明显，可进行区分。通常使用VIP 值来说明变量与分类的重要性，VIP 值越大，该元素在产地间的差异越显著，各变量的VIP 值如表2所示。为筛选导致地区差异的重要影响因素，以VIP 值大于1为指标，得到可区分产地的重要矿物元素为：Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Ga、Sr、Y、Cd、Sb、Ba、Tb、Dy、U。

图1 不同产地陈皮的PLS-DA散点图Fig.1 Scatter plot of citrus reticulata blanco in different origins

表2 PLS-DA模型中不同矿物元素的VIP值Table 2 VIP values of mineral elements in PLS-DA model

2.2 矿物元素指纹图谱的建立

矿物元素含量是一组独立的离散数据，无法直接得到指纹图谱。将矿物元素按VIP 值大小进行排序，以矿物元素为横坐标，矿物元素含量为纵坐标，构建得到矿物元素-含量关系图。从图2可知，新会陈皮中矿物元素的含量差别大，其中钾元素含量高达107μg/kg，在含量关系图中占主导地位。但单一的峰形导致矿物元素指纹图谱无法反映陈皮不同产地间的差别。鉴于此，本文对不同矿物元素含量进行系数缩放。

为消除微量元素与高含量元素的含量差异引起的误差，将矿物元素根据平均含量大小分为6 类，不同类别的缩放系数不同，具体分类及缩放系数见表3。同时，为了使地区差异更为明显，选取VIP值大于1（表2），方差分析p值小于0.05（表1）的元素进行分析（共9 种，分别为Sr、Mg、Cu、K、Ga、Mn、Ba、Na、Cd），构建指纹图谱，基于18 批新会陈皮绘制的矿物元素指纹图谱见图3。整体而言，各样本之间存在含量差异，但指纹图谱曲线趋势大致相同，矿物元素分布特征相似，因此可基于该趋势特征进行产地溯源。

图3 新会陈皮指纹图谱Fig.3 Element fingerprint of Xinhui citrus reticulata blanco

表3 矿物元素分类和缩放系数Table 3 Mineral element classification and scale factors

为消除个例样品的影响，以18批新会产陈皮中矿物元素的平均含量作为该地陈皮中矿物元素的标准含量，构建新会陈皮的矿物元素标准指纹图谱，见图4。

图4 不同产地陈皮中矿物元素的标准指纹图谱Fig.4 The standard fingerprint of mineral elements from different producing areas

2.3 陈皮产地鉴别模型的建立

将指纹图谱向量化，通过计算余弦相似性对陈皮矿物元素指纹图谱进行相似度评价。基于新会陈皮矿物元素标准指纹图谱，采用向量相似法计算18批新会陈皮矿物元素指纹图谱与标准指纹图谱的余弦相似度，结果见表4，相似度为0.941~0.998。定义相似度阈值为某样品指纹图谱与标准图谱相似度的最小值，得到新会陈皮矿物元素指纹图谱的相似度阈值为0.941。通过构建不同产地矿物元素指纹图谱并计算其与新会陈皮标准指纹图谱的相似度进行产地判别，相似度高于阈值0.941，可判定属于新会陈皮，反之不属于。

表4 18批新会陈皮矿物元素指纹图谱与标准指纹图谱的相似度Table 4 Similarity between 18 batches of Xinhui samples with the Xinhui standard fingerprints

2.4 以元素指纹图谱鉴定陈皮产地

为了验证所建鉴别模型的准确性，选取新会陈皮6 批、广西陈皮9 批、湖南陈皮9 批作为验证样品，建立各验证样品的矿物元素指纹图谱，并计算其与新会陈皮标准指纹图谱的相似度，结果见表5。其中，22批样品判断正确，编号XH-22的样品误判为非新会陈皮，编号GX-6的样品误判为新会陈皮，产地判别正确率为91.6%。

表5 实际样品验证结果Table 5 Validation results of actual samples

虽然新会陈皮纳入模型组的批次较少，导致相似度阈值存在偏差，但在相同的测量条件下，建立的矿物元素指纹图谱仍能有效判别陈皮产地。采用相同方法建立了广西和湖南产地陈皮的标准指纹图谱，结果显示，广西陈皮与新会陈皮标准指纹图谱的相似度较高。3地陈皮的标准指纹图谱见图4。

3 结 论

通过分析新会、广西、湖南3 地陈皮中的51 种矿物元素含量及其组成特征，选用不同产地陈皮中存在显著性差异的9 种元素建立了各产地陈皮矿物元素指纹图谱和新会陈皮标准指纹图谱。通过计算各产地陈皮矿物元素指纹图谱与新会陈皮标准指纹图谱之间的相似度，进行样品产地溯源。对24批未知产地陈皮进行产地判别，正确率为91.6%，方法可用于陈皮的产地溯源。但该研究建立的新会陈皮标准指纹图谱仅能用于判断未知产地陈皮样品是否来自新会，具体产地判别及陈皮生长储存年限对元素含量及标准指纹图谱的影响有待进一步研究。