高效液相色谱测定青金桔中19种酚类物质方法的研究

刘帅光,张红建,马泽威,王青松,吴 豪,郑联合

海南省粮油科学研究所 (琼海 571400)

酚类是一种广泛存在于果蔬中的功能活性物质,主要包括酚酸和类黄酮。柑橘中含有诸如橙皮苷、根皮素、柚皮苷、山奈酚等多种酚类物质[1],具有抗氧化、消炎、抗癌、降血脂、肠道保护、心血管保护等生理作用[2-6],因此,天然柑橘多酚类展现出了作为食品添加剂和功能性食品强化剂的巨大潜力,相关研究已被广泛报道并为大众所接受。

青金桔是一种芸香科柑橘族金柑属作物,主要分布于我国海南、台湾两省及越南、马来西亚等东南亚地区[7,8],其口感酸爽、香味清新而备受当地消费者欢迎。青金桔果实中富含芹菜素、牡荆苷、橙皮苷、对香豆素等多种功能活性成分[9,10],海南省年产量可达20万t左右,但开发利用率低,缺乏精深加工产品。目前青金桔相关基础研究较少,其中多酚类化合物组成、定量研究更是鲜有报道。因此,探究青金桔果实中多酚的含量及组成对于青金桔的开发及高值加工利用具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青金桔,购自海南省琼海市嘉积镇中心市场;地奥司明、橙皮苷、柚皮苷、柚皮素、川陈皮素、桔皮素、新西兰牡荆苷、圣草次苷、绿原酸、7-羟基香豆素、龙胆酸、柠檬苦素、没食子酸,均为分析标准品,HPLC≥98%,上海源叶生物科技有限公司;根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷、金柑苷、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷、Isomargaritene、Margaritene,均为分析标准品,HPLC≥98%,武汉天植生物技术有限公司;根皮苷,分析标准品,HPLC≥98%,阿拉丁试剂有限公司;乙腈、甲醇,色谱纯,德国CNW公司;甲酸,色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;二甲基亚砜,色谱纯,上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XPR105型十万分之一电子天平,Mettler Toledo公司;LGJ-10NS/GC型冷冻干燥机,北京亚星仪科科技发展有限公司;UltiMate 3000型高效液相色谱仪(配备赛默飞DAD检测器),美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1样品制备

青金桔样品前处理:新鲜青金桔全果洗净晾干后分离出果皮、果肉、果汁。将果皮、果肉冷冻干燥后研磨成均匀粉状,取果皮、果肉冻干粉0.2 g准确加入10 mL 70%甲醇水溶液,混合均匀后于360 W、50 ℃条件下超声提取30 min,提取液于5 000 r/min条件下离心10 min,取上清液过0.22 μm滤膜,4 ℃贮存备用。果汁于5 000 r/min条件下离心10 min,取上清液过0.22 μm滤膜,4 ℃贮存备用。样品稀释至适当浓度后进行测定。

1.3.2高效液相色谱条件

经过前期实验调整并参考Russo[11]等人方法略作改动,确定高效液相色谱分离条件如下:流动相A为乙腈∶甲酸(99.9∶0.1,v/v),流动相B为水∶甲酸(99.9∶0.1,v/v);柱温30 ℃;进样量10 μL;波长210 nm。梯度洗脱程序:0 min:5%A;40 min:25%A;60 min:100%A;70 min:100%A;73 min:5%A;80 min:5%A。

1.3.3标准曲线的建立

将1.1材料与试剂中19种标准物质利用甲醇-二甲基亚砜溶液,梯度配置成质量浓度范围为0.2～200 μg/mL的混合标准溶液。在1.3.2条件下进样测定,以标准物质质量浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线及线性回归方程。

1.3.4方法学考察

1.3.4.1 检出限及定量限

取配置的混合标准溶液,逐级进行梯度稀释并按照1.3.2条件测定,以3倍信噪比(S/N)确定检出限浓度,以10倍信噪比确定定量限浓度。

精密度:取同一浓度混合标准溶液,按照1.3.2方法连续进样测定6次(n=6),计算19种多酚物质的含量及保留时间的计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.3.4.2 回收率实验

按照1.3.1进行样品制备时按照5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的3个浓度加入混合标准溶液,进样后计算不同浓度下的加标回收率。平行3次测定,并计算RSD。

1.3.4.3 稳定性、重复性实验

稳定性:取同一待测样品,与室温条件下(约25 ℃)避光贮存0、3、6、9、12、24 h后,按照1.3.2方法连续进样测定,并计算各多酚物质含量的RSD。

重复性:取同一样品,按照1.3.1平行6次进行样品制备(n=6),并测定样品中各多酚含量RSD。

1.3.5数据处理与分析

实验中所有指标平行3次测定。高效液相色谱结果采用变色龙7.0软件进行处理,使用SPSS Statistics 23对各组均值进行单因素方差分析和显著性分析,以P<0.05表示显著性水平。

2 结果与讨论

2.1 混合标准溶液图谱及线性方程

混合标准溶液高效液相色谱图如图1所示,保留时间依次是没食子酸8.95 min、绿原酸21.15 min、龙胆酸21.78 min、新西兰牡荆苷26.03 min、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷33.97 min、圣草次苷34.49 min、7-羟基香豆素35.42 min、根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷36.42 min、柚皮苷41.57 min、地奥司明41.95 min、Margaritenen 42.43 min、橙皮苷42.77 min、根皮苷46.17 min、Isomargaritene 46.96 min、金柑苷48.64 min、柚皮素51.69 min、柠檬苦素54.51 min、川陈皮素55.47 min、桔皮素57.09 min。各标准物质目标峰之间分离情况良好,可用于样品的进一步定性分析。

注:1.没食子酸;2.绿原酸;3.龙胆酸;4.新西兰牡荆苷;5.牡荆素-2″-O-鼠李糖苷;6.圣草次苷;7.7-羟基香豆素;8.根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷;9.柚皮苷;10.地奥司明;11.Margaritenen;12.橙皮苷;13.根皮苷;14.Isomargaritene;15.金柑苷;16.柚皮素;17.柠檬苦素;18.川陈皮素;19.桔皮素。

以各标准物质的质量浓度与峰面积绘制线性方程,结果如表1所示。各标准物质在线性浓度范围内相关系数在0.993～0.999之间,呈现较好的线性关系,可用于样品的定量分析。

表1 标准曲线回归分析

2.2 方法检出限、定量限与精密度

以3倍信噪比和10倍信噪比确定19种多酚物质的检出限、定量限如表2所示,检出限范围为0.052～2.344 μg/mL,定量限范围为0.173～7.813 μg/mL。该方法所测定19种多酚保留时间RSD在0.01%～0.32%,峰面积RSD在0.84%～4.74%,检测精密度良好。

表2 方法检出限、定量限与精密度

2.3 加标回收率

样品中5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL这3个浓度的加标回收率浓度如表3所示,19种多酚的平均加标回收率在95.54%～101.64%,RSD在0.11%～4.83%,加标回收效果良好。

表3 样品加标回收率

2.4 方法稳定性和重复性

本实验方法稳定和重复性情况分别见表4、表5。样品在0～24 h内测定结果的稳定性较好,19种多酚物质含量稳定性RSD在0.66%～3.79%。同一样品6次平行实验的多酚含量RSD在0.38%～2.22%。

表4 方法稳定性

表5 方法重复性(n=6)

2.5 样品中多酚含量

青金桔果实中果皮、果肉、果汁中的多酚含量如表6所示。青金桔果皮、果肉、果汁中19种多酚及柠檬苦素化合物含量差异显著(P<0.05),主要的多酚物质以黄酮类为主,分别为根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷、橙皮苷、新西兰牡荆苷、圣草次苷、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷。根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷是青金桔中最为主要的多酚类物质,在果皮、果肉、果汁中的含量分别为3 053.667 mg/100 g、811.671 mg/100 g、288.332 μg/mL,远高于其他酚类物质。此外,果皮中仍具有较高含量的金柑苷、根皮苷、川陈皮素、桔皮素、Isomargaritene等酚类,而果肉中则相对表现出较低水平。果汁中除根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷外含有较高的新西兰牡荆苷(56.665 μg/mL)。

表6 样品中多酚含量

由表6可知,青金桔果皮中各多酚含量均多于果肉,且多酚种类多于果肉及果汁。没食子酸在青金桔果皮、果肉、果汁中均未检出,7-羟基香豆素在果肉中未检出,根皮苷、Isomargaritene在果肉及果汁中均未检出。就果皮、果肉、果汁而言,柠檬苦素多集中于果皮之中。

3 结束语

柑橘中大多数酚酸通过形成酯或糖苷键与果实中的细胞壁结合[12],大量研究表明柑橘属植物含有丰富的黄酮苷,如柚皮苷、橙皮苷等,但C-糖苷类化合物却含量较少且并不常见,本研究中青金桔果皮、果肉、果汁中均含有十分丰富的根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP),并且与Lou等[13]人在相似金桔品种中的DGPP含量的检测结果相似.。DGPP属于二氢查尔酮衍生物[14],可以通过竞争性抑制对酪氨酸酶具有良好的抑制效果[15],这展现出其在于美白化妆品方向上的广阔前景。

此外,青金桔多酚化合物的提取方式上可进一步优化。Yu-M等使用HPLC法测定了Calamondin(加利蒙地亚桔;四季桔)皮的热水提取物,检测出了主要类黄酮物质为根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP)、柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素和桔皮素[16]。另有研究表明,Calamondin桔皮的热水提取物(90 ℃)中DGPP含量高于有机溶剂提取物,桔皮提取物的总多酚、总黄酮、酚酸含量高于果肉且具有更好的抗氧化性,这也说明其中多酚化合物多具有亲水性[17,18]。高温提取可增加多酚提取量,但会使DGPP、橙皮苷等部分黄酮产生降解[18]。本研究采用70%甲醇对青金桔果皮、果肉进行提取,后期可对比热水提取、甲醇-二甲基亚砜提取效果,探求最佳提取方式。

橙皮苷是青金桔含量中仅次于DGPP的多酚黄酮类化合物,具有多种生物活性,如:抗氧化[19]、抗癌[20]、消炎抗溃疡[21]等。青金桔果皮、果汁中圣草次苷是一种黄烷酮糖苷,主要存在于柠檬、酸橙类水果中,具有抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、降血脂等广泛的生物活性[22]。青金桔果皮中川陈皮素和桔皮素含量显著高于果肉(P<0.05),川陈皮素和桔皮素属于多甲氧基黄酮(PMFs),多存在于果皮之中,具有抗氧化、抗癌、调节代谢、神经保护、免疫调节、肠道菌群调节的多种生理活性[23-25]。柠檬苦素是一种三萜类化合物,是柑橘苦味的主要来源之一。由于柠檬苦素独特的抗肿瘤、抗虫、抗炎、抗病毒等生理活性而被用于食用或药用[26]。青金桔的果皮、果肉、果汁中均检测出含量较为丰富的柠檬苦素,这同时也展现出青金桔具有良好的功能活性价值。

青金桔中多酚含量及种类可能受果实成熟度的影响,Hsu等[27]研究表明未成熟的Calamondin果皮中的总多酚和类黄酮含量高于成熟的,未成熟的果皮提取物抗氧化活性和DPPH自由基清除率(56.9%～64.3%)也远高于成熟的(35.0%～48.9%)。在青金桔的开发过程中可根据加工要求的不同而选取合适成熟度的果实加以利用。

青金桔中丰富的多酚类化合物尤其是DGPP具有应用于保健食品、药品和化妆品的巨大潜力,但提取方法、生物活性应用效果及作用机制仍待进一步探索。青金桔皮中多酚化合物含量显著多余其他部位,因此在青金桔的加工中应注意果皮的利用。此外,本研究中青金桔果皮、果肉、果汁HPLC检测中均另有几个峰面积较大的未知峰,而柑橘类果实中较为常见的如:新橙皮苷、芦丁、橙皮素、阿魏酸等多酚类物质因实验条件限制未得全部测定,对于未知峰具体成分以及青金桔不同成熟期的多酚化合物成分及含量变化情况也需进一步探讨。

本实验采用高效液相色谱法建立了一套青金桔果皮、果肉、果汁中19种多酚及柠檬苦素的测定方法,在线性浓度范围内各标准物质线性相关系数在0.993～0.999,检出限在0.052～2.344 μg/mL,定量限在0.173～7.813 μg/mL,保留时间RSD在0.01%～0.32%,峰面积RSD在0.84%～4.74%,该方法具有良好的线性关系和精密度。各标准物质回收率在95.54%～101.64%,回收率RSD在0.11%～4.83%,回收率良好。24 h内各标准物质含量稳定性RSD在0.66%～3.79%,同一样品6次平行实验的多酚含量RSD在0.38%～2.22%,表明该方法稳定性、重复性均符合要求。该方法可用于青金桔样品中19种多酚及柠檬苦素物质的定性和定量分析。青金桔果皮、果肉、果汁中主要多酚物质为根皮素-3′,5′-二-C-β-葡萄糖苷(DGPP)、橙皮苷、新西兰牡荆苷、圣草次苷、牡荆素-2″-O-鼠李糖苷,其中DGPP含量尤为丰富。果皮中的19种多酚及柠檬苦素种类及含量显著高于果肉及果汁。青金桔中丰富的多酚及柠檬苦素具有良好的食用及药用价值和较大开发利用前景。综上所述,本研究建立一套青金桔中19种多酚及柠檬苦素的高效液相色谱检测方法,并首次测定了青金桔中多酚及柠檬苦素的组成及含量,为青金桔进一步开发利用提供基本的理论借鉴和参考。