脂肪酶法制备富含DHA甘油酯的研究

张士龙,王 鑫,把宗国

中粮粮油工业(巢湖)有限公司 (巢湖 238000)

二十二碳六烯酸(DHA),作为一种ω-3多不饱和脂肪酸,是人体必需的多不饱和脂肪酸,具有很多重要的生理功能,如调节人体的脂质代谢、降低血液粘稠度和胆固醇水平、降分,能促进婴幼儿的脑部和视力的机能发育,有利于智力、学习和记忆能力的提高[1]。DHA目前存在的主要方式有两大类,一是甘油三酯型(微藻油);二是乙酯型(鱼油)。研究显示,乙酯形式的DHA在人体内难以被消化吸收,游离形式易氧化,气味口感难以被接受,而甘油酯形式的DHA既保持了原有的生物学活性和生理功能,不易氧化,又易于被人体吸收利用,气味口感更加温和。

微藻油与鱼油二者DHA含量均较低,可以采用适当方法富集以提高DHA的含量。富集方式通常有两种,即脂肪酶法和传统的物理化学法。脂肪酶富集DHA主要通过酶促水解、酯化、酯交换、醇解等方式来实现。传统物理化学方法主要有低温结晶、金属沉淀、尿素包合等。

与传统的低温结晶、金属沉淀、尿素包合等物理化学富集方法相比,利用脂肪酶法合成富含DHA的甘油酯,具有高效性、选择性好、产品质量高、反应条件温和等优点[2]。因此利用天然的脂肪酶来富集DHA的方法越来越多的被学者们采用。研究表明,脂肪酶主要来源有两大类:一是以动植物及真菌为代表的真核生物;二是以细菌等为代表的原核生物,二者的获取既可采用组织提取方式又可采用微生物培养方式。脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶,它催化天然底物油脂水解,生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶,可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应等。脂肪酶也是一种活性蛋白质。因此,一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性,受温度、pH值、脂肪酶浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。

1 脂肪酶在富集DHA工艺中的应用

1.1 脂肪酶促水解

鱼油甘油酯分子的三个酯键具有空间差异性,ω-3多不饱和脂肪酸大多位于2位上,而大多数脂肪酶作用在1,3位点。由于不同脂肪酶对于不同脂肪酸具有特异性,因此在脂肪酶的催化下,鱼油发生选择性水解,从而富集DHA。水解是一种平衡反应,因此DHA只能浓缩到一定水平。为了提高DHA的含量,可以重复水解反应混合物中分离出的含DHA组分。

朱东奇等[3]研究了重组米根霉脂肪酶(rProROL)的酶学性质,并且将其用于催化水解鳀鱼油富集DHA,发现rProROL水解三油酸甘油酯时具有显著的sn-1,3位置专一性。水解产生的甘油二酯中DHA含量达到19.7%,单甘酯中DHA含量达到25.2%,DHA的回收率可以达到65.6%。

刘国艳等[4]以小黄鱼内脏精炼鱼油为原料,通过脂肪酶选择性水解法富集DHA和EPA,最终产物EPA和DHA甘油酯总含量为21.65%,高于精炼鱼油(12.35%)。

1.2 脂肪酶促酯化

水解纯化得到高纯度的DHA后,先使DHA与甘油二者在酶存在体系下进行酯化反应,待反应达到平衡后进行分离提纯。使用该方案能得到较高纯度的DHA甘油三酯,但是工作效率较低,成本较高。

孙兆敏等[5]首先通过技术手段(氯仿-甲醇混合液)将裂殖壶菌总脂提取出来,然后在反应体系中加入特定脂肪酶,将其转化为乙酯型,再借助分子蒸馏技术手段可将乙酯中的DHA含量由原有的40%提升至80%以上。另外,李道明等[6]使用原料为富含DHA的脂肪酸和甘油,在游离脂肪酶和固定化脂肪酶作用下通过两阶段酯化反应合成高含量甘油三酯。其中一阶段先用游离脂肪酶催化,反应达到平衡时富含DHA脂肪酸的酯化率达到67%。二阶段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反应后的油相,结果显示脂肪酸的转化率提高到96%以上,甘油三酯的含量也可提高40%以上。

1.3 脂肪酶促酯交换

将DHA或其乙酯加入到含有DHA的甘油三酯中,再辅用酶催化酯交换反应,可得到更高DHA含量的甘油三酯。根据国外学者研究结果,原料甘油酯中DHA的初始含量和加入的DHA纯度二者是脂肪酶促酯交换反应得到高纯度DHA终产物的主要影响因素。相较于酯化,酯交换对高纯度DHA要求较低,但其缺点也很明显,反应速度相对较慢且反应不完全[7]。

李金章等[8]通过将乙酯型和甘油酯型相互转换的方式,可以将乙酯型中的EPA、DHA富集到甘油酯型当中,得到的甘油三酯其EPA、DHA含量较高。郑建永等[9]以乙酯型鱼油和甘油酯型鱼油为原料在米曲霉脂肪酶催化下进行酯酯交换反应得到高含量EPA/DHA甘油酯,探讨了最优酶催化反应条件。在最优的酶催化反应条件下反应18 h,产物中EPA和DHA含量可达到接近40%左右。在优化条件下重复使用米曲霉菌丝体,产品中的EPA和DHA含量仍保持稳定状态,变化较小。

1.4 脂肪酶促醇解

醇解产生的脂肪酸乙酯相较于水解产生的游离脂肪酸有易于分离的特点,因此被更多学者采用。脂肪酶在醇解反应时对长不饱和脂肪酸不敏感,反应效率较低,采用此方法可以将鱼油中DHA转化为甘油酯的形式富集。

醇解反应主要影响因素有:水分含量、醇的种类。研究者们对比了不同种类醇参与的醇解反应,研究发现月桂醇、乙醇和异丙醇等几种醇是比较好的反应原料。

杨博等[10]对部分醇解鱼油进行了研究,对油醇比、酶加量的相关实验表明在油醇比2∶5、酶加量5%(质量比)条件下,鱼油中DHA含量由26.1%提高了接近17%。潘志杰等[11]利用填充床酶反应器进行了脂肪酶催化精炼海洋鱼油和乙醇通过连续式的部分醇解反应富集甘油酯型DHA和EPA的研究。

2 脂肪酶法的优化

2.1 脂肪酶催化反应条件的优化

影响脂肪酶催化反应的因素有很多,如反应底物配比、反应温度、时间、酶种类、酶添加量等,通过实验探讨这些因素的影响规律,调节最优反应条件,使转化效率达到最高,可节省生产成本,提高产品质量。

李丽帆等[12]使用固定化脂肪酶对粗鱼油进行选择性水解,分析了加酶量、含水量、温度、反应时间对富集过程的影响规律,得出最优反应条件:2 g粗鱼油,2.5 g水,221.3 U脂肪酶,30 ℃,反应11.7 h,再进行二次水解,EPA和DHA的质量分数分别从原始的4.2%和18.9%提高到8.5%和42%。

石红旗等[13]对脂肪酶水解制备DHA甘油酯产品的工艺条件进行了研究,比较了数种脂肪酶对鱼油水解的效果,发现国产解脂假丝酵母脂肪酶水解效果最佳。

多位学者对脂肪酶反应条件进行研究探索,酶种类来说国产解脂假丝酵母脂肪酶水解效果较好,其他反应条件如温度、时间、底物浓度比等则需要更进一步的研究探索。

2.2 酶催化方法的优化

事实上,仅用脂肪酶催化酯化的方法并不高效,需要在催化反应之前对DHA进行提纯操作。通过提纯反应产物后,可得到由混甘油三酯的混合物,其中甘二酯含量最高。若使甘油三酯为主要成分的产物,可以通过将该混甘油三酯的混合物和一定量的游离脂肪酸进行酯化反应,使混甘油三酯的混合物中甘油三酯含量达到最高。

另外,还有学者采用两阶段酶法反应制备富含EPA/DHA的甘油酯。其中一阶段先用游离脂肪酶催化,反应达到平衡时二阶段再利用固定化脂肪酶下催化上一步反应后的油相,这样可以得到以甘油三酯为主的EPA/DHA甘油酯产品。

通过提纯以及采用两阶段酶法反应等优化方法来富集DHA,富集的DHA含量有显著提升,这些优化方法值得被采用推广。

2.3 与其它技术的联用

2.3.1酶的优化

虽然脂肪酶催化活力高、专一性强、反应条件温和,但游离酶难以与产物分离,且只能发生一次反应,对环境的耐受性差。为了提高酶的稳定性和回收利用率,常对脂肪酶进行固定化处理。诸如采用交联、吸附、包埋、共价结合等方法对酶进行固定化处理。刘向前等[14]研究利用树脂对脂肪酶Lipozyme CALB L进行固定化,然后将固定化酶用于催化富含EPA和DHA的脂肪酸乙酯与甘油进行酯交换反应合成甘油酯。

酶催化反应一般在酶反应器中进行,其是根据酶的催化特性专门研究开发的一种设备,可以带来的好处有:提高效率、降低成本、降低能耗,产生更好的经济效益。

2.3.2蒸馏分离

分子蒸馏技术特别适于高沸点、易氧化、热敏性物质的分离,被广泛应用。具有如下特点:压力低、受热时间短、避免多不饱和脂肪酸的氧化、高真空、连续分离操作。

很多学者利用分子蒸馏技术分离脂肪酶促酯化和醇解之后的混合产物,从而富集产物中的DHA。另外,蒸馏还是降低鱼油中游离胆固醇含量的一种有效途径。在脂肪酶促反应过程中,鱼油中的游离胆固醇会形成酯化形式,难以与油相分离。因此可以在脂肪酶催化反应之前,利用短程蒸馏去除胆固醇,在酶催化和提纯后胆固醇含量仍保持在低水平。

与其他技术联用能更大程度的发挥脂肪酶催化效果以及商业化程度,有着更好的经济效益,为富集DHA提供更好的选择。

3 结束语

与日本、欧美等国家相比,我国对于鱼油中DHA富集的研究起步较晚,但近年来发展迅速,且取得一定成效。但还有以下方向可以探索:如活性更高的酶制剂、更好的酶固定化方法、更先进的DHA分离提纯方法以及更新型的生物反应器等,致力于制备高纯度高质量的DHA产品。随着人们生活质量的提升,保健意识的增强,富含DHA的产品等保健产品具有广阔的商业前景。