微波灰化-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定茶叶中的铬酸铅

刘 欠 吴绮莉 潘春秀

(1.中钢集团马鞍山矿山研究总院股份有限公司,安徽 马鞍山 243000;2.安徽工业大学,安徽 马鞍山 243000)

随着茶叶保健功能的深入研究可知,茶叶中含有多种功能营养成分,如茶多酚类、茶氨酸、茶多糖等,其中茶多酚因含有较多的酚羟基,据相关研究表明,茶叶中的茶多酚具有抗氧化、抗衰老、抗癌变、降低血脂和胆固醇、抑菌消炎以及防治心血管疾病和保护心肌等多种药理作用[1],近年来,茶叶深受人民喜爱。但是随着人们生活水平的不断提高,人们在关注茶叶营养成分的同时,也开始重视茶叶中的有害物质[2]。

铅铬绿又称“美术绿”,其成分主要由铬酸铅和铁蓝或者酞箐蓝组成,由于其颜色鲜艳,价格低廉,近年来常被不法商贩所利用,添加于茶叶成品中使茶叶的颜色变绿,提高茶叶的色泽度,以次充好[3-5]。铅铬绿中含有大量的铅和铬,大量的摄入对人体的健康造成严重危害,如果被添加于茶叶中,人在饮用的过程中大量的摄入铅会对造血系统、神经系统和肾脏等造成严重损害[6-9]。同时,铬通过铬酸根或者重铬酸根的形态通过带负电荷的细胞膜,并且促使氧化,从而导致病变发生,具有致癌和诱发基因突变的作用[10]。因此,测定茶叶中非法添加剂铅铬绿具有重要意义。

铅铬绿是一种混合物,很难通过特定的物质对其进行定量和定性分析。一般通过测定茶叶中的铅和铬的含量,以此来推断茶叶中是否添加了铅铬绿[5,9,11-14],这些方法虽然能够准确测定茶叶中的铅和铬,但是不能明确茶叶中铅和铬的来源。直到2019年5月BJS201910《茶叶中美术绿(铅铬绿)的测定》的发布,为茶叶中铅铬绿的测定提供了依据。但是该标准的第一篇第一法高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)测定茶叶中铬酸根时,消除样品干扰的方法采用的是电炉灼烧法,以最大功率灼烧茶叶至无白烟。本文经过研究发现使用电炉灰化茶叶时仍存在一些弊端。一方面,由于电炉型号不同使用的最大功率也不同,导致灼烧温度不同,从而影响茶叶灰化的效果及样品的准确度测定[3,15]。另一方面,由于电炉很小,每个电阻丝的温度不同,样品放在电炉上会受热不均匀,影响茶叶灰化的时间和灰化效果,同时不利于批量样品的同时测定。此外电炉受外界干扰比较多,容易导致样品的污染。相关研究表明微波灰化[16-20]和马弗炉煅烧[16,21-22]均能消除样品本身的干扰。但是马弗炉在高温煅烧前需要对样品进行蒸发水分和除去有机质等碳化过程,过程比较繁琐且时间比较长,容易对样品造成污染。另外,马弗炉煅烧不能隔绝空气,容易导致Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)的转化[3]。微波灰化是一种新型的灰化技术,无需炭化可以直接快速升温灰化,冷却时间较快,节约了样品分析的时间,灰化效果好。因此,本文采用微波灰化茶叶除去有机物,然后用碱性提取液提取灰分中的铬酸根,利用HPLC-ICP-MS测定提取液中的铬酸根,结合茶叶中铅的测定结果推测出茶叶中铬酸铅的含量,为茶叶中是否添加了铅铬绿提供了判定依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器

Agilent 7900电感耦合等离子质谱仪,Agilent 1260高效液相色谱仪,CEM PHOENIX微波灰化仪(美国CEM公司),HJS-6型水浴恒温磁力搅拌器(金坛市仪纯仪器有限公司),G3268-80001色谱柱(30 mm×4.6 mm,5 μm,美国Agilent)。

1.2 试剂与材料

硝酸(优级纯,德国默克公司),铬酸铅、氢氧化钠、无水碳酸钠和氨水(优级纯,国药集团化学试剂有限公司);Be、Ce、Fe、In、Mg、Pb、U的混合标准调谐液(1.0 μg/L,美国珀金埃尔默公司),六价铬标准溶液(100 mg/L,国家有色金属及电子材料分析测试中心);Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司)。

取10.0 g NaOH和15.0 g Na2CO3,水定容至1 L,得到0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3的混合碱性提取液。

硝酸铵溶液(0.05 mol/L):一定量水中加入3.4 mL硝酸和3.7 mL氨水,定容至1 L,摇匀;用10%硝酸溶液或10%氨水溶液调节pH值至7.0～7.2,得到50 mmol/L的硝酸铵缓冲盐溶液。

1.3 样品制备

茶叶样品去杂后粉碎,过0.425 mm筛,称取过筛样品1.000 g(精确至0.001 g)于瓷坩埚中,放入微波灰化炉中在500 ℃,灰化时间50 min条件下灰化至白灰状,灰化程序见表1。灰化完成冷却至室温,取出样品加入30 mL的碱性提取液,置于磁力搅拌恒温水浴锅中,在90～95 ℃下不间断搅拌10 min,取出后冷却至室温,转移至100 mL容量瓶中,从中取1.0 mL用0.05 mmol/L的硝酸铵溶液定容至50 mL,用10%的硝酸调节pH值至7.0～7.2,过0.45 μm水系微孔滤膜,上机测定,同时做样品空白。

表1 微波灰化程序升温模式

1.4 仪器条件

用调谐液调谐仪器,使仪器灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等各项指标达到测定要求,主要仪器参数见表2。

表2 HPLC-ICP-MS主要参数

1.5 标准曲线配制

标准中间液的配制(10.0 mg/L):准确移取1.00 mL六价铬标准储备溶液(100 mg/L)于10.0 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸铵溶液定容至刻度,得六价铬标准中间液为10.0 mg/L。

标准使用液的配制(1.00 mg/L):准确移取10.0 mL六价铬标准中间液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸铵溶液定容至刻度,得六价铬标准使用液为1.00 mg/L。

标准工作溶液的配制:分别吸取0、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 mL标准中间液于100 mL容量瓶中,用0.05 mmol/L的硝酸铵溶液定容、混匀,过水系微孔滤膜(0.45 μm),待上机测定。该标准工作液六价铬的浓度分别为0、5.00、10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L。该标准工作液现用现配。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法

目前国内外报道的常用六价铬提取方法有碱提取[3,23-27]、缓冲盐溶液提取[28-30]、ASE提取[31]、超声辅助提取[10,31]等。结合相关文献,本文先用0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液直接提取添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶叶30 min,提取完成后转移至100 mL容量瓶中并定容,上机测定。结果发现Cr(Ⅵ)没有检出,与王莹等[3]研究结果一致;本文又参照超声辅助提取法,用0.05 mol/L pH值为7.0～7.2的硝酸铵缓冲溶液超声提取同一添加量的茶叶30 min,提取完毕后8 000 r/min离心,取上清液,重复提取2次,合并上清液,上机测定。结果发现Cr(Ⅵ)的回收率只有30%。其原因一方面是茶叶中含有多酚类的还原性有机化合物,在碱性提取和超声辅助提取的过程中,同时也把茶叶中的茶多酚类化合物提取出来,在样品处理的过程中将Cr(Ⅵ)还原成Cr3+[30,32];另一方面是茶叶具有吸附性,能够吸附样品中的Cr(Ⅵ),导致Cr(Ⅵ)的回收率不高[33-35]。根据倪张林等[16]的研究结果可知,Pb2CrO4在高温条件下非常稳定。因此,为了消除茶叶基质的干扰,本文先对茶叶进行灰化处理,然后再提取灰分中的Pb2CrO4。

2.2 灰化方式的选择

据相关报道可知,电炉灼烧、微波灰化以及马弗炉煅烧均能消除样品本身的干扰,但是马弗炉在高温煅烧前需要对样品进行碳化,而微波灰化仪可以直接快速升温灰化,且冷却时间较快。因此,本文选择电炉灼烧和微波灰化两种方式进行比较,进一步研究更有利于消除茶叶基质干扰的灰化方式。

2.2.1 电炉灼烧灰化法

本文选择4种添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)的茶叶分别在800、1 000、2 000 W使用功率下灼烧灰化茶叶,用于研究电炉功率对测定茶叶中Pb2CrO4含量的影响。实验结果发现,由于样品基质的不同,同一功率下样品的回收率测定结果差异很大,达到最高回收率时电炉的功率也不同。由表3可以发现,茶叶3无论电炉使用功率是1 000 W还是2 000 W均不能灰化完全;茶叶2虽然在1 000 W下能灰化完全,但是回收率仅有55%,测定总铬发现总铬的回收率也只有65.92%;然而,茶叶1和茶叶4在1 000 W条件下就能灰化至灰白色,且样品回收率均达到80%以上。4种茶叶同一功率下不同的灰化效果反应了电炉灼烧法的灰化效果受样品基体的影响很大,说明电炉灼烧法不能够满足所有茶叶的测定要求,不具有普遍适用性。

表3 不同灰化功率下茶叶回收率的测定结果

另外,由表3还可以发现,茶叶1和茶叶4在使用功率达到2 000 W时,回收率反而只有50%左右,结合茶叶2总铬的回收率只有65.92%的测定结果,分析其原因可能是高温下铬与炭发生反应,生成难溶的碳化铬化合物,这一结果与李冰茹等[17]研究结果一致。为了进一步验证在电炉灼烧的过程中存在Cr(Ⅵ)转化,在同样的条件下灰化茶叶2,灰化后向其中加入100 mg/kg的Cr(Ⅵ)标液,在90～95 ℃下不间断搅拌10 min,取出后冷却至室温,转移至100 mL容量瓶中,从中取1.0 mL用0.05 mol/L的硝酸铵溶液定容至50 mL,用10%的硝酸调节pH值至7.0～7.2,过0.45 μm水系微孔滤膜,上机测定。结果发现六价铬的回收率几乎100%,证明了在电炉灼烧茶叶样品时存在Cr(Ⅵ)转化,同时也说明在碱提取10 min的过程中不存在Cr(Ⅵ)的转化。

2.2.2 微波灰化法

与电炉相比,微波灰化法隔绝空气,能够降低Cr3+向Cr(Ⅵ)的转化[16-17]。本文参照微波灰化法测定茶叶的总灰分程序升温方法[20]将上述4种茶叶[添加了100 mg/kg Cr(Ⅵ)]在500 ℃条件下,灰化40 min。按照拟定的碱提取方式,提取灰分,然后上机测定Cr(Ⅵ)的回收率,实验结果见表4。结果发现4种茶叶均灰化完全,测定Cr(Ⅵ)的回收率在85%～95%。与电炉灼烧法相比,微波灰化法灰化效果好、准确度高,能够满足茶叶样品的测定要求。因此选择微波灰化作为茶叶的灰化方式。

表4 微波灰化法测定茶叶中Cr(Ⅵ)的回收率结果

2.3 微波灰化条件的优化

微波灰化温度和灰化时间是影响灰化效果的重要因素[16]。选择茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)],按照拟定前处理方式,分别考察了灰化温度和灰化时间对茶叶中铬酸根测定结果的影响,优化了灰化温度和灰化时间等条件。

2.3.1 灰化温度的优化

在灰化时间40 min条件下,分别研究灰化温度400、450、500、550、600 ℃对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中铬酸根测定结果的影响。由表5可知,在450 ℃以下,茶叶灰化不完全,灰分中有较多的黑色炭颗粒,加标回收率不高;当灰化温度在550 ℃以上时,虽然茶叶灰化完全,但是由于高温Cr(Ⅵ)可能与茶叶中的矿物质发生反应,生成难溶的碳化铬化合物,导致加标回收率不高;因此选择500 ℃作为茶叶灰化温度,加标回收率达90.2%。实验结果如表5所示。

表5 不同灰化温度下茶叶中Cr(Ⅵ)的加标回收率结果

2.3.2 灰化时间的优化

灰化时间是影响灰化效果另一个重要因素。在灰化温度500 ℃的条件下,分别考察了灰化时间10、20、30、40、50 min对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]中铬酸根测定结果的影响,由表6可知灰化时间太短,茶叶样品灰化不完全,回收率测定结果偏低,随着灰化时间的增加,灰化效果越好,在灰化时间50 min的条件下,灰化效果最好,回收率达98%。结合灰化温度和灰化时间的测定结果可知,灰化温度500 ℃,灰化时间50 min是茶叶样品的最佳灰化条件。

表6 不同灰化时间下茶叶中Cr(Ⅵ)的加标回收率结果

2.4 提取液的选择

据报道,目前常用的提取液有NaOH和Na2CO3混合碱提取液[3,15]、水及EDTA和硝酸铵混合提取液[28]等。据王莹等[3]研究结果可知0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液是提取茶叶中铬酸根的最佳浓度。同时,又考虑到提取液与流动相的基体不一致,影响基线的稳定性。本研究在最佳的微波灰化条件下分别研究了0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液和0.05 mol/L,pH值为7.0～7.2的硝酸铵缓冲溶液对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)]灰分中铬酸铅提取效果的影响。结果发现0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液和0.05 mol/L的硝酸铵提取液均能很好地提取灰分中添加的Cr(Ⅵ)。由于茶叶3样品中本底铬酸根未检出,添加的Cr(Ⅵ)回收率好,只能说明0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液和0.05 mol/L的硝酸铵提取液能够很好地提取添加的六价铬离子。为了证实这一结论,称取0.027 9 g铬酸铅,分别用上述两种提取液在相同条件下提取,转移至1 000 mL容量瓶中,稀释500倍,上机测定六价铬的含量。结果0.05 mol/L的硝酸铵提取液中没有Cr(Ⅵ)检出,而0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液中Cr(Ⅵ)的检测含量与理论值(20 μg/L)基本一致,说明Na2CO3和NaOH对茶叶中的Pb2CrO4具有更好的提取能力,因此选择0.25 mol/L的NaOH和0.14 mol/L的Na2CO3混合碱性提取液作为茶叶中Pb2CrO4的提取液。

2.5 碱提取条件的优化

2.5.1 提取液体积的优化

考虑到碱的浓度能够影响色谱柱的寿命、仪器的稳定性以及Cr3+向Cr(Ⅵ)的转化率[36]。在最佳的灰化条件下,分别研究了提取液体积对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+转化的影响。实验结果如表7所示,由表7可以看出,当提取液体积达到30 mL时,Cr(Ⅵ)的回收率为90.5%,Cr3+的转化率也很低,随后随着提取液体积的增加,Cr(Ⅵ)的回收率基本保持不变。因此选择30 mL作为碱提取液的提取体积。

表7 不同提取体积下Cr(Ⅵ)的提取结果及Cr3+的转化结果

2.5.2 提取时间的优化

提取时间是影响茶叶中铬酸根提取率的关键因素之一,同时也影响Cr3+向Cr(Ⅵ)转化。在茶叶最优的灰化条件下,分别研究了提取时间对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+转化的影响。实验结果见表8,由表8可知,随着提取时间的增加,Cr(Ⅵ)的回收率和Cr3+转化率基本变化不大,从节能环保提高效率考虑,选择10 min作为茶叶灰分中铬酸根的提取时间。

表8 不同提取时间下茶叶中Cr(Ⅵ)的提取结果和Cr3+的转化结果

2.5.3 提取温度的优化

提取温度是影响铬酸根提取率和Cr3+向Cr(Ⅵ)转化的另一因素。本研究在茶叶最优的实验条件下,分别研究了提取温度对茶叶3[添加了100 mg/kg的Cr(Ⅵ)和100 mg/kg的Cr(Ⅲ)]中Cr(Ⅵ)提取及Cr3+转化的影响。实验结果见表9,由表9可以发现,随着提取温度的增加,Cr(Ⅵ)的回收率逐渐增加,Cr3+转化率基本不变,提取温度为95 ℃时,Cr(Ⅵ)的回收率最高,Cr3+转化率低,因此选择95 ℃作为茶叶灰分中铬酸根的提取温度。

表9 不同提取温度下茶叶中Cr(Ⅵ)的提取结果和Cr3+的转化结果

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围

按照实验方法测定52Cr标准系列,以浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,建立标准曲线。结果相关性良好,相关系数为0.999 8,满足GB/T 27404—2008规定的要求。

2.6.2 检出限和定量限

检出限按3倍的信噪比所产生的信号响应对应的浓度表示。通过将样品空白中添加0.5 μg/L的Cr(Ⅵ)标准溶液产生的相应信号约为噪声的3倍。因此,方法最低检出浓度为0.5 μg/L。当称样量为1.000 g,定容体积为100 mL,稀释50倍时,Cr(Ⅵ)检出限为2.5 mg/kg,定量限为7.5 mg/kg。

2.6.3 精密度和准确度

为了进一步验证该方法的准确度和精密度,对茶叶3进行三水平加标,6次平行测定,用于计算该方法的准确度和精密度。准确度结果用加标回收率表示,精密度结果用RSD表示。实验结果见表10。从表10可知,加标回收率在91.3%～95.3%,精密度结果在1.1%～2.0%,均符合GB/T 27404—2008中的规定要求。表明该方法精密度高、准确度良好,完全满足茶叶中铬酸根的测定。

表10 精密度和准确度测定结果

3 结论

比对了电炉灼烧和微波灰化两种灰化方式的测定结果,建立了微波灰化-HPLC-ICP-MS法测定茶叶中铬酸铅的方法,并对灰化温度、灰化时间、碱提取液体积、提取时间以及提取温度进行了优化。实验结果表明该方法检出限低至2.5 mg/kg,三水平加标回收率在91.3%～95.3%,精密度结果在1.1%～2.0%。研究表明,该方法检出限低,灵敏度高,准确度结果良好,能够满足茶叶中铬酸铅的测定。