广州腹泻与健康非腹泻人群产气荚膜梭菌检出率及MLST分型

姚淑雯,邹 洁,钟华敏,杨 敏,龙 燕,梁秉绍△

1.广州医科大学附属妇女儿童医疗中心检验科,广东广州 510623;2.广州医科大学金域检验学院,广东广州 510000;3.广州医科大学附属妇女儿童医疗中心消化科,广东广州 510623

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌,是一种革兰阳性厌氧的粗大芽孢杆菌,广泛存在于自然界中,是创伤性气性坏疽和食物中毒的主要病原菌[1];产气荚膜梭菌食物中毒是美国、日本第二大常见的细菌性食源性疾病,在美国每年病例近100万人[2-3]。近年来,我国已有关于产气荚膜梭菌食物中毒的病例报道[4-6]。产气荚膜梭菌是人体肠道内的条件致病菌,一般情况下不致病,当抗菌药物的使用破坏了正常菌群,使它在肠道过度繁殖并产生外毒素时,会导致腹泻等症状[1]。

产气荚膜梭菌多位点序列分型(MLST)是2012年由XIAO等[7]建立的一种基于8个管家基因核酸序列的分型方法。到目前为止PubMLST数据库[8]已经包括了571种序列型,而且数据库查询不到的分型结果可以通过上传数据到数据库得到新的序列型,这有利于不同实验室分型数据的比较。我国同时比较腹泻和健康人群粪便产气荚膜梭菌检出率和分子特征的前瞻性研究少见报道,因此本研究对腹泻和健康非腹泻人群的粪便标本进行产气荚膜梭菌的分离培养及鉴定,并进行MLST分型,以期为产气荚膜梭菌所致食源性疾病病原学判断和溯源提供依据。现报道如下。

1 资料和方法

1.1一般资料 收集2021年10—12月在广州医科大学附属妇女儿童医疗中心(以下简称本中心)诊断为腹泻患者和行健康体检的健康非腹泻人群的新鲜粪便标本和腹泻患者大便肛管保存液标本296例,排除同一人先后多次或同时送2种类型样本的情况。按照标本类型与人群的不同,分为腹泻儿童粪便组(104例)、腹泻儿童肛管组(68例)、非腹泻儿童粪便组(30例)和非腹泻成人粪便组(94例)。腹泻人群的纳入标准：24 h排便3次以上,且粪便性状有明显改变[9]。健康体检人群纳入标准：粪便标本性状和检验结果均正常。所有研究对象均知情同意。本研究经本中心医学伦理委员会审批通过(审批号：[2020]第44501号)。

1.2方法

1.2.1产气荚膜梭菌的分离培养 取绿豆大小的新鲜粪便或200 μL大便肛管保存液于庖肉培养基中,80 ℃水浴箱中水热15 min。置于二氧化碳培养箱37 ℃培养24～48 h。于“汹涌发酵”的庖肉培养基中吸取20 μL培养液定量接种于血平板,置于厌氧袋,于37 ℃培养18～24 h。

1.2.2产气荚膜梭菌的鉴定 使用美国布鲁克·道尔顿 MALDI-TOF质谱仪进行菌株鉴定。取血平板上可疑的单个菌落,均匀涂抹于MALDI靶板的标本孔位上,记录标本位置和编号。加入1 μL甲酸溶液于相应标本孔位上,自然干燥。标本干燥后加1 μL基质溶液,自然干燥。按质谱仪的控制面板上绿色IN/OUT键,待ACCESS绿灯亮后打开靶板舱盖子。靶板放入靶板仓,放平,轻轻盖上盖子,按绿色IN/OUT将靶板送入仪器内,启动IVD MALDI Biotyper软件进行鉴定。

1.2.3随机抽样和菌株复苏 从腹泻儿童粪便组、腹泻儿童肛管组、非腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组随机抽取若干例阳性菌株,将甘油和LB培养基冻存的产气荚膜梭菌菌株室温平衡10 min,取10 μL菌液接种于血平板上,放置于37 ℃条件下厌氧培养24 h。

1.2.4DNA模板制备 基于前期研究中使用的煮沸裂解法制备DNA用于聚合酶链反应(PCR)检测,挑取2～3个菌落置于200 μL的Tris-EDTA缓冲液中,置100 ℃沸水中煮沸10 min,在冰上冷却5 min后12 000 r/min离心2 min,取上清液作为模板[10]。

1.2.5引物设计和PCR扩增 根据参考文献[7]合成8个管家基因的引物,引物名称和序列见表1。使用艾科瑞生物 Accurate Taq DNA聚合酶进行扩增。每个反应的最终体积为50 μL,包含DNA模板1 μL,2×Taq PCR Star Mix预混液25 μL,上下游引物各1 μL,RNase Free水22 μL。使用Biometra PCR仪进行扩增,循环条件如下：95 ℃ 30 s,98 ℃变性10 s,在52 ℃退火30 s,在72 ℃延伸60 s,然后进行35个循环,最后72 ℃延伸15 min。PCR产物送华大基因进行双向测序。

表1 引物名称和序列

1.2.6MLST分型 将序列提交到PubMLST数据库(https：//pubmlst.org/organisms/clostridiumpe-rfringens)进行分析,得到每个管家基因的等位点序号,然后依据每株细菌8个管家基因的等位点序号得出其MLST型别。新的管家基因等位点号和ST型都上传至数据库中,得到新的序列型。

1.2.7不溶血型产气荚膜梭菌的全基因组测序和验证 使用艾瑞科细菌基因组提取试剂盒提取相应菌株全基因组,送华大基因进行全基因组测序。使用Species Finder-2.0在线分析工具(https：//cge.food.dtu.dk/services/SpeciesFinder/)对病原菌进行验证。使用在线微生物基因组注释工具(Rapid Annotation using Subsystem Technology,RAST)对基因组序列进行注释,运用Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)对16S rRNA基因进行比对分析。

1.3统计学处理 使用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数或率表示,组间比较采用χ2检验或Fisher概率检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组人群的临床特征分析 腹泻儿童粪便组年龄19 d至10岁,中位年龄为9个月;男59例(56.7%),女45例(43.3%);主要来自门诊内科(50.0%)和消化专科(30.8%)。腹泻儿童肛管组年龄21 d至13岁,中位年龄为1岁;男49例(72.1%),女19例(27.9%);主要来自消化专科(47.1%)和急诊科(23.5%)。非腹泻儿童粪便组年龄8个月至8岁,中位年龄为3岁6个月;男14例(46.7%),女16例(53.3%);主要来自耳鼻喉外科(46.7%)和口腔科(16.7%)。非腹泻成人粪便组年龄21～80岁,中位年龄为59岁;男10例(10.6%),女84例(89.4%)。

2.2产气荚膜梭菌检出率 腹泻儿童粪便组的104份标本经疱肉培养基增菌并转血平板厌氧培养后,使用质谱鉴定为产气荚膜梭菌标本有38份,检出率为36.5%;其中血平板上没有典型双层溶血环的菌株有9株,占阳性菌株的23.7%(9/38)。腹泻儿童肛管组的68份标本中,检出产气荚膜梭菌标本11份,检出率为16.2%,其中血平板上没有典型双层溶血环的菌株有2株,占阳性菌株的18.2%(2/11)。非腹泻儿童粪便组的30份标本中,检出产气荚膜梭菌阳标本14份,检出率为46.7%,所有菌株均具有典型的双层溶血环。非腹泻成人粪便组的94份标本中,检出产气荚膜梭菌标本50份,检出率为53.2%,其中血平板上没有典型双层溶血环的菌株有4株,占检出菌株的8.0%(4/50)。以入组人群是否腹泻进行比较,结果显示非腹泻人群(包括非腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组)产气荚膜梭菌的检出率为51.6%(64/124),高于腹泻人群(包括腹泻儿童粪便组和腹泻儿童肛管组)的23.8%(41/172),差异有统计学意义(P=0.02)。以入组人群的年龄进行比较,结果显示非腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组产气荚膜梭菌的检出率(46.7%vs.53.2%)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。以入组人群标本的采集方法进行比较,结果显示腹泻儿童肛管组产气荚膜梭菌的检出率最低(16.2%),与腹泻儿童粪便组检出率(36.5%)比较,差异有统计学意义(P=0.04)。

2.3产气荚膜梭菌MLST分型 随机抽取4组共34株产气荚膜梭菌,以产气荚膜梭菌的DNA为模板,使用PCR方法得到扩增产物,共检测8个管家基因,包括毒素基因(plc,colA)、应激反应基因(groEL,sod)、代谢基因(pgk,nadA)、DNA复制基因(gyrB)和sigma因子(sigK)基因。对PCR产物进行测序和拼接后通过PubMLST数据库进行分型。34株产气荚膜梭菌共分为31种序列(ST)型,以ST210最多,分别为腹泻儿童肛管组2株和非腹泻儿童粪便组1株,占所有菌株的8.82%(3/34)。ST400有2株,腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组各分布1株,其余已知序列型包括ST82,ST170,ST1184,ST214,ST324,ST344,ST387,ST397,ST430,ST472,ST515。由于数据库开放使用的时间不长,数据库的等位基因不多,因此本研究的部分菌株并不能直接在数据库找到相同的序列,新的等位基因位点序列和新ST型已经上传至PubMLST网站,共发现18种新ST型菌株,占52.92%(18/34),分别为ST546～ST560和ST574～ST576,4组均有新ST的菌株。

2.4不溶血型产气荚膜梭菌的全基因组测序和验证 随机选取不溶血型产气荚膜梭菌1株,使用Species Finder-2.0在线分析工具对基因组序列进行分析,结果显示该不溶血菌株确实为产气荚膜梭菌,匹配的菌株为ABDX01000038。对基因组进行注释后,使用其16S rRNA基因进行BLAST比对分析,结果亦显示与公布的产气荚膜梭菌基因组FORC_003(CP009557.1)的同源性达100.00%。

3 讨 论

产气荚膜梭菌是气性坏疽、食物中毒和抗生素相关腹泻的主要病原菌,同时是人体肠道内的正常菌群。据李红新等[11]研究报道,北京顺义区的健康人群粪便中产气荚膜梭菌的检出率为64.37%。本次前瞻性研究发现广州地区非腹泻人群(包括了儿童和成人)粪便中产气荚膜梭菌检出率为51.6%,且非腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组产气荚膜梭菌的检出率(46.7%vs.53.2%)比较,差异无统计学意义(P>0.05)。表明健康人粪便中普遍携带产气荚膜梭菌,且年龄对其检出率的影响比较有限。

本研究中,腹泻儿童粪便组产气荚膜梭菌检出率为36.5%,明显高于腹泻儿童肛管组的检出率(16.2%),差异有统计学意义(P=0.04),说明粪便采集方法对产气荚膜梭菌检出率有较大影响,使用肛管采样后置于营养肉汤中对产气荚膜梭菌并没有起到增菌效果,反而有可能因为采集的粪便量不足而影响检出率。本研究腹泻儿童肛管组的检出率(16.2%)与WANG等[12]研究中成人腹泻患者粪便标本产气荚膜梭菌13.8%的分离率比较接近。本研究发现,腹泻儿童粪便产气荚膜梭菌检出率比非腹泻人群粪便的低,说明腹泻儿童的病原体可能有较多种,而且仅仅粪便中产气荚膜梭菌阳性不意味着它一定致病。因为产气荚膜梭菌食物中毒一般是由于患者食用了含有大量产气荚膜梭菌污染的肉制品和其他菜肴与汤汁导致,这些食物通常是煮熟后在较高温度下长时间缓慢冷却时导致细菌大量繁殖并产生外毒素[13],所以还与摄入产气荚膜梭菌的数量和产生毒素的多少密切相关。因此在产气荚膜梭菌食物中毒事件中,需要增加细菌的定量分析,一般认为可疑食品里细菌的数量>105 CFU/g或病例的粪便中细菌的数量>106 CFU/g[14]即可确诊。

一般食物中毒的调查分析过程中会通过毒素基因分型或者脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法分析比较患者粪便与残留食物标本中检出菌株的一致性来判断相关的病原体[15]。但是笔者前期试验结果显示广州地区腹泻人群大部分为A型产气荚膜梭菌[16],因此毒素基因分型方法难以区分产气荚膜梭菌分型,PFGE方法难以进行实验室间比较。MLST是2012年由XIAO等[7]建立的一种基于8个管家基因核酸序列的分型方法,该方法重复性好,而且有利于不同实验室菌株的比较,是一种非常有效的分子分型方法。但由于建立时公共数据库包括的序列型有限,新的序列型亦没有更新上传到数据库,因此新序列型查询不到相应的ST型,从而限制了该分型方法的应用。很多研究人员因此根据不同的管家基因或者引物序列重新建立起其他MLST分型方案,但是不同的分型方案并不利于地区间菌株的比较,甚至会导致混淆[17-19]。截至目前,该数据库已经包括了571种序列型,新序列型也可以得到相应的分型结果。本研究随机抽取4组34株产气荚膜梭菌共分为31种ST型,以ST210最多,占8.82%,共发现18种新ST型菌株,占52.92%,说明该方法可以从基因水平对菌株进行区分。由于食物被产气荚膜梭菌污染及粪便产气荚膜梭菌携带均较为常见,因此进一步在基因水平上对菌株进行分型有助于甄别真正的病原菌[20]。WANG等[12]对153例粪便标本产气荚膜梭菌以同样的方法进行MLST分型,与本研究中相同的ST分型有ST324、ST387、ST397、ST400。在本研究中ST400有2株,分布于腹泻儿童粪便组和非腹泻成人粪便组。

不溶血型产气荚膜梭菌因为菌落形态不典型,所以往往容易漏检。以往文献对该类不典型菌株的报道甚少。笔者在使用质谱对其鉴定的基础上进一步运用全基因组测序方法对其进行验证,结果显示该不溶血型菌株可分离自3组人群的粪便,而且在腹泻儿童粪便中的检出率更高。临床检验技术人员在日常工作中需要密切关注该类型产气荚膜梭菌检测。

总之,广州地区腹泻和健康人群粪便产气荚膜梭菌的检出率较高,且检测出不溶血型菌株。MLST分型是一种非常有效的分子分型方法,可以从基因水平对菌株进行区分,并且能够追踪到菌株遗传上的亲缘关系,为产气荚膜梭菌食物中毒的诊断和溯源提供可靠依据。