支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平与气道炎症、肺功能的关系

崔云会

河南省商丘市第一人民医院分子生物实验室 476000

支气管哮喘作为威胁全球范围内的一种严重公众健康慢性呼吸道疾病,目前以儿童发病率最高,根据流行病学调查发现,儿童哮喘患病率为3.3%～29.0%,且患病率总体上仍在上升[1]。虽目前关于该疾病具体发病机制尚未完全阐明,但气道炎症在支气管哮喘发病中起关键作用[2]。MicroRNA作为调节基因表达的单链非编码小分子RNA,目前研究发现其参与多种信号通路的调节[3]。近年来已有研究发现miRNA与哮喘气道炎症关系密切,其可通过基因水平调控哮喘发生发展[4]。既往有研究显示,血清miR-30a与极低体重儿支气管肺发育不良相关[5]。同时有研究发现,miR-15b-5p可作为哮喘—慢性阻塞性肺病重叠的生物标志物[6]。但目前研究关于外周血miR-30a、miR-15b-5p与支气管哮喘患儿的关系尚不清楚。因此,本研究拟分析支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平与气道炎症、肺功能的关系,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2020年3月—2022年3月我院收治的123例支气管哮喘患儿纳入研究组,其中男66例,女57例,年龄2～14岁,平均年龄(7.85±1.22)岁。(1)纳入标准:①符合支气管哮喘诊断标准[7];②均签署知情同意书;③年龄2～15岁者。(2)排除标准:①伴有重要脏器功能不全者;②合并感染性疾病、心血管疾病、急慢性感染疾病以及恶性肿瘤疾病者;③既往伴有哮喘病史、其他过敏性疾病家族史及其他免疫性疾病者;④近期存在免疫抑制剂、糖皮质激素等治疗史者;⑤近期上呼吸道感染史者;⑥临床资料不全者;⑦不配合治疗、中途退出研究者。另外选择同期在我院体检的100例健康儿童作为对照组,其中男60例,女40例,年龄3～15岁,平均年龄(8.10±1.52)岁。本研究经我院伦理委员会审核批准。

1.2 方法 (1)外周血miR-30a、miR-15b-5p检测:获得本研究纳入对象同意后,抽取入院24h内的空腹外周静脉血5ml送检,室温下以3 500r/min离心15min后取清液,存放至-80℃冰箱内备用。取出血清样本后按照比例加入提取试剂Trizol后充分摇匀,随后参照miRNA试剂盒提取血清总miRNA。再使用RNA逆转录盒合成cDNA,反应体系15μl,逆转录反应条件:37℃15min,85℃5s。利用分光光度计检测cDNA浓度,将cDNA稀释后取2μl作为模板,采用7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)检测,并以U6作为内参照。PCR仪器设置参数为95℃、5min、40个循环,95℃、10s、40个循环,90℃、1min、40个循环;miR-30a引物,正向:5’-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGCT-3’,反向:5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3’,引物长度235bp;miR-15b-5p引物,正向:5’-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3’,反向:5’-TCTCAGATGGTGAGCGAG-3’,引物长度176bp。最后采用CFXmanager3.0软件对Cq值进行分析,再通过2-Δt法(Δt=CTmiRNA-CTU6)计算血清miR-30a、miR-15b-5p的相对表达量。本研究所有试剂盒均由博士德生物有限公司生产。(2)气道炎性细胞检测:获得本研究纳入对象同意后收集咳出痰液送检,观察记录各组细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数目。(3)肺功能指标检测:由受过专业培训的实验者采用MasterScreen肺功能检测仪测定所有受试者用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气量(FEV1%)、第1秒用力呼气量占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)等肺功能指标,每位受试者均测定2次,最终结果取平均值。

2 结果

2.1 两组外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比较 研究组患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于对照组(P<0.05),见表1。

表1 两组外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比较

2.2 两组气道炎性细胞检测比较 研究组患儿诱导痰中的细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞的数目均高于对照组(P<0.05),巨噬细胞的数目低于对照组(P<0.05),见表2。

表2 两组气道炎性细胞检测比较

2.3 两组肺功能指标比较 研究组患儿FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指标均低于对照组(P<0.05),见表3。

表3 两组肺功能指标比较

2.4 支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p与气道炎症、肺功能的相关性 Pearson相关分析显示,支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水

平均与肺功能指标(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬细胞呈负相关(P<0.05),与细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞数目呈正相关(P<0.05),见表4。

2.5 外周血miR-30a、miR-15b-5p对小儿支气管哮喘的预测价值 ROC曲线分析显示,外周血miR-30a、miR-15b-5p预测小儿支气管哮喘发生的曲线下面积为0.841(95%CI:0.792～0.890)、0.862(95%CI:0.817～0.917),二者联合预测小儿支气管哮喘发生的曲线下面积为0.911(95%CI:0.874～0.958),见表5、图1。

图1 外周血miR-30a、miR-15b-5p对小儿支气管哮喘的预测ROC曲线

表5 外周血miR-30a、miR-15b-5p对小儿支气管哮喘的预测价值

3 讨论

miRNA作为由21～25个核苷酸组成,有着超强的稳定性的非编码单链RNA分子,参与细胞分化、基因调控、肿瘤发生等多种生物学功能,目前已经被公认为是生物体内的重要调控分子[8-9]。既往研究发现miRNA中的miR-145-5p、RNAmiR-21等均可通过介导炎症反应等影响支气管哮喘的病理生理过程[10-11]。而miR-30a、miR-15b-5p虽也作为miRNA成员之一,但李智慧等[12]miR-30a通过靶向调控E盒结合锌指蛋白2抑制非小细胞肺癌的迁移与侵袭;但丛鹏等[13]研究显示,肝细胞癌患者血清miR-30a表达水平低于正常人群。Ma等[14]研究发现,miR-15b-5p可抑制STAT3表达从而减轻2型糖尿病相关肺结核小鼠的肺损伤;Salimi等[15]研究显示,miR-15b-5p在外界毒物致肺损伤过程中明显升高。

本研究分析外周血miR-30a、miR-15b-5p水平在支气管哮喘患儿中发现,研究组患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于对照组(P<0.05),提示外周血miR-30a、miR-15b-5p水平可能参与支气管哮喘的发生,与以上某些研究结论一致。嗜酸粒细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞都是目前常见的炎症细胞,而本次研究分析结果显示,研究组患儿诱导痰中的细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞的数目均高于对照组,巨噬细胞的数目低于对照组(P<0.05),说明支气管哮喘患儿诱导痰液中的炎症细胞数目显著增多,进一步提示患儿气道存在明显的炎症反应。

同时本研究结果显示,研究组患儿FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指标均低于对照组(P<0.05),说明支气管哮喘患儿存在肺部气流受限。本研究相关分析显示,支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均与肺功能指标(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬细胞呈负相关,与细胞总数、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、淋巴细胞数目呈正相关(P<0.05),说明miR-30a、miR-15b-5p与支气管哮喘患儿气道炎症及气流受限关系密切,且外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可能导致患儿发生气道炎症反应及呼气气流受限,进而加重疾病进展。本研究ROC曲线分析显示,外周血miR-30a、miR-15b-5p预测小儿支气管哮喘发生的曲线下面积为0.841、0.862,说明外周血miR-30a、miR-15b-5p均对小儿支气管哮喘的发生有着良好的预测价值,且其水平超过截断值,提示存在支气管哮喘发生风险。

相关研究报道,支气管哮喘发作与气道炎症、变态反应、气道高反应性等相互作用有关[16]。既往研究显示,外周血淋巴细胞中miR-30a-5p高表达可使脓毒症患者促炎因子表达上调,抗炎因子表达受到抑制[17],而血清miR-30a也与脓毒症病情严重程度有关[18]。而既往研究涉及更多的是miR-15b-5p调节肿瘤细胞生长与凋亡的功能,但有研究发现,血清miR-15相对表达量参与溃疡性结肠炎患者炎性反应状态[19]。因此本研究推测,外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可机体出现炎症反应,因此有可能导致支气管哮喘发生。另外研究发现,外周血miR-30a联合miR-15b-5p预测小儿支气管哮喘发生的曲线下面积高于单一指标,说明二者联合应用更有助于诊断小儿支气管哮喘发生,从而可为临床及时采取积极有效的治疗干预措施提供依据。

综上所述,支气管哮喘患儿外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均呈高表达,且水平变化与气道炎症、肺功能密切相关,另外可作为预测支气管哮喘患儿发病的有效指标。但本研究为单中心样本分析,可能存在选择偏倚,因此后续研究中将扩大样本来源单位进一步分析。