嵌合型抗原受体T细胞在恶性黑色素瘤中应用进展

张立坤 岳武恒 邹征云

1南京中医药大学太仓附属医院皮肤科,江苏太仓, 215400;2南京中医药大学太仓附属医院肿瘤科,江苏太仓, 215400;3南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心,江苏南京,210008

恶性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一类起源于黑素细胞的恶性肿瘤,可发生于皮肤黏膜等部位[1,2],我国每年约新增2万MM病例,约占所有恶性肿瘤的1%,在欧美国家MM是最常见的致死性皮肤肿瘤之一。恶性黑素瘤恶性程度高,易发生远处转移(常见于肝、肺、骨、脑),预后差[3,4]。尽管目前已有免疫卡控点抑制剂(例如PD-1单抗、CTLA-4单抗)及BRAF/MEK抑制剂(例如索拉菲尼、维莫拉非尼、达普拉非尼)等靶向与免疫药物在临床应用,但仍面临患者免疫反应性有限、肿瘤耐药性产生、潜在的严重毒副作用等因素制约,仅部分患者可从中获益[5,6]。嵌合型抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是近年来备受瞩目的工程化肿瘤特异性T细胞疗法,对表达特定靶点的肿瘤细胞进行特异性杀伤,可一定程度上克服信号通路分子靶向抑制剂的耐药性[7],并避免免疫卡控点抑制剂的延迟效应[8]。恶性黑素瘤存在丰富的细胞膜表达标志物,可作为治疗靶点,因此CAR-T在MM肿瘤免疫治疗中具有一定的潜力价值,本文就近年来CAR-T疗法在恶性黑素瘤中的研究进展作介绍。

1 恶性黑素瘤免疫治疗研究现状

恶性黑素瘤免疫治疗药物主要包括免疫卡控点抑制剂、细胞因子、免疫激动剂单抗等[9],涉及相关免疫分子有[10]:①免疫卡控点分子:PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3;②免疫激活作用的配体分子:4-1BB、OX40;③细胞因子:IL-2、IFNα-2b。此外,肿瘤疫苗及工程化T细胞等策略也在MM免疫治疗中也展开积极探索,临床试验结果展示出良好疗效[11,12]。

以免疫卡控点抑制剂为代表的单克隆抗体已在MM免疫治疗中广泛应用,诸如伊匹单抗Ipilimumab(CTLA-4单抗)、帕博利珠单抗Pembrolizumab(PD-1单抗)、纳武单抗Nivolumab(PD-1单抗)等免疫卡控点抑制剂已获批临床应用于恶性黑素瘤治疗[13,14]。此外,OX40单抗等免疫激动剂抗体在治疗恶性黑素瘤临床试验中也展现出较强的免疫激活作用,活化增强T细胞抗肿瘤效应[15,16]。免疫卡控点抑制剂这类单克隆抗体药物虽然在部分患者中取得良好疗效,但长期用药过程中仍观察到严重毒副作用而被迫中断疗程[17],尤其在66岁以上老年患者中有30%以上发生免疫相关不良事件[18,19],对毒副作用的预防和及时治疗显得尤为重要。目前已有多种单克隆抗体联合使用,或单克隆抗体联合化疗的临床探索,增强免疫治疗效果的同时期望减少药物毒副作用。

白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是重要的免疫调节剂,高剂量IL-2可有效促进效应T细胞活化增殖,增强抗肿瘤活性[20]。高剂量IL-2治疗进展期MM虽然在部分患者中可延长生存期,但是高剂量IL-2易引起严重毒副作用,例如低血压、心律失常、谵妄等,因此通常将IL-2联合PD-1单抗或联合SBRT放疗可取得更佳疗效,并控制相关毒副作用发生[21-23]。干扰素-α-2b(interferon-alpha-2b,IFN-α-2b)具有杀伤肿瘤细胞,增强抗肿瘤免疫反应的作用[24],高剂量IFN-α-2b已作为恶性黑素瘤术后高危复发人群的辅助治疗手段,但临床试验结果显示,其对总体生存期的改善并没有达到预期效果[25],且高剂量IFN-α-2b也伴有流感样症状、皮肤变态反应等副作用[26],仍需进一步优化联合用药。

肿瘤疫苗主要包括细胞负载疫苗(以DC细胞疫苗为主)、多肽疫苗(以化学合成多肽为主)、基因疫苗(以DNA、mRNA为主),配合相应免疫佐剂,可联合其他免疫药物应用于MM肿瘤免疫治疗[27]。肿瘤疫苗采用的MM靶点包括S-100、Gp100、Melan、MITF及SOX10等肿瘤抗原[28],肿瘤疫苗联合细胞因子疗法(IL-2、IFN-α-2b),在多项恶性黑素瘤临床试验中展现了一定的疗效[29,30],但是肿瘤疫苗发挥疗效需经历肿瘤抗原递呈、免疫细胞识别抗原、T细胞活化增殖、诱导产生特异性杀伤T细胞等一系列漫长的免疫应答过程,不利于进展期恶性黑素瘤的疾病控制,研究者将肿瘤疫苗与工程化T细胞联合应用于MM免疫治疗,增强短期内对肿瘤进展的控制,并获得持续的抗肿瘤免疫效应[31]。由于恶性黑素瘤除了RAS、BRAF突变外缺乏更多可用于疫苗靶点的高频热点突变[32],而兼具有强免疫原性的泛突变靶点则更有限,疫苗靶点设计需充分考虑个体化定制,潜在获益人群局限,这也给进一步的临床转化带来挑战。相比之下,CAR-T细胞针对的肿瘤靶点为MM特异性生物标志物,对抗原的免疫原性及递呈水平无严格要求,潜在获益人群更广[33],尽管CAR-T在实体瘤中存在脱靶效应、免疫微环境抑制等制约因素的挑战[34],但目前CAR-T细胞在进展期及转移性MM临床试验中,单用或联合其他免疫疗法均展示出一定的临床应用价值,在传统免疫药物之外提供了新的发展方向,值得深入探究。

2 CAR-T治疗黑素瘤作用机制

CAR-T细胞经基因工程改造,表达嵌合型抗原受体CAR,经典结构包含①胞外段的抗原靶向结构域;②穿膜段;③胞内段的共刺激结构域;④胞内段的T细胞激活结构域。CAR-T细胞在回输人体后,由靶向结构域(例如单链抗体)特异性结合黑素瘤细胞表面抗原,并通过共刺激结构域(例如CD28、4-1BB)以及T细胞激活结构域(CD3)进行信号转导,刺激CAR-T细胞增殖、活化,释放TNF-α、IFN-γ、IL-6等细胞因子,激活免疫系统对黑色素瘤细胞进行杀伤,同时,CAR-T分泌的穿孔素与颗粒酶素可直接对肿瘤细胞杀伤。此外,CAR-T自身 实现抗肿瘤疗效。

CAR-T细胞作用机制明确,呈现出特异性强、免疫激活效应广泛、不依赖于肿瘤抗原递呈水平及免疫原性等特点,具有广阔的临床应用前景,目前已有多项CAR-T细胞疗法获批临床应用于血液系统肿瘤,而在恶性黑素瘤,尤其是转移性黑素瘤,已开展多项CAR-T临床试验,临床转化潜力不俗。

3 CAR-T细胞疗法在恶性黑素瘤中的应用

CAR-T细胞为T细胞经基因工程技术改造而来,由嵌合型抗原受体中包含的抗原识别模块特异性结合肿瘤细胞表面生物标志物,抗原结合后进行CAR-T细胞活化信号转导,刺激T细胞特异性免疫应答,CAR-T随后快速活化增殖并释放杀伤性细胞因子,杀伤表达靶点抗原的肿瘤细胞。基于MM肿瘤细胞表面的多种生物标志物,可作为CAR-T靶点的有双唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside GD2,GD2)、硫酸软骨素蛋白多糖4(chondroitin sulfate proteoglycan-4,CSPG4)、纽约食管鳞状细胞癌-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NYESO-1)、人黑色素肿瘤相关抗原(Glycoprotein gp100,Gp100)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、肿瘤坏死因子配体超家族成员7(tumor necrosis factor ligand superfamily member 7,TNFSF7,又称CD70)等,部分靶点的CAR-T疗法已在相应抗原阳性表达MM患者中开展临床试验,以评估疗效及安全性。

3.1 Anti-GD2 CAR-T 神经节苷脂GD2作为CAR-T靶点在多种肿瘤中应用,在恶性黑素瘤中GD2表达率为38%[35],目前有多项临床前研究及临床试验评价Anti-GD2 CAR-T在恶性黑素瘤中疗效。Gargett等[36]利用Anti-GD2 CAR-T联合PD-1单抗,可对GD2及PD-L1阳性肿瘤细胞造成有效杀伤,并在Ⅰ期临床试验(ACTRN12613000198729)研究发现,在转移性恶性黑素瘤患者中该联合策略有效延长Anti-GD2 CAR-T在体内持续免疫应答反应,抑制肿瘤生长,且未观察到严重不良反应事件。以GD2为靶点的CAR-T在转移性MM(NCT02107963)、难治性/复发性MM(NCT02482532)、转移性葡萄膜MM(NCT03635632)中已有多项临床试验开展,旨在评价其安全性及有效剂量,试验结果暂未公布。除了联合PD-1单抗,Shum等[37]将IL-7细胞因子受体(IL-7 cytokine receptor,C7R)基因转入Anti-GD2 CAR-T,以进一步增强工程T细胞活化增殖及抗肿瘤活性,动物实验结果显示,经C7R修饰的CAR-T组比对照T细胞组生存期延长近2倍,目前该CAR-T的Ⅰ期临床试验(NCT03635632)仍在进行中。

3.2 Anti-HER2 CAR-T HER2在恶性黑素瘤中表达率虽然不及其他靶点丰度高,仅为3%[35],但在葡萄膜恶性黑素瘤这类型MM中表达是显著升高的,HER2是其重要靶点之一[38]。因葡萄膜MM对免疫卡控点抑制剂等常规免疫治疗药物不敏感,并且驱动基因GNAQ及GNA11缺乏成药性而无靶向药物,所以研究者将攻克重点转向Anti-HER2 CAR-T,体外实验结果显示葡萄膜MM肿瘤细胞对Anti-HER2 CAR-T敏感,在人源化小鼠模型中,Anti-HER2 CAR-T可有效抑制葡萄膜MM及皮肤MM生长,并且有部分小鼠为完全缓解状态,证实该CAR-T在葡萄膜恶性黑色素瘤治疗中具有应用前景[38]。目前HER2相关CAR-T的Ⅰ期临床试验已启动(NCT04483778),研究者将采用第二代CAR-T结构进行多靶点的免疫细胞治疗,HER2作为被评估靶点之一,其结果将对Anti-HER2 CAR-T后续的临床应用提供参考。

3.3 Anti-VEGFR2 CAR-T 血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)与恶性黑素瘤血管生成及肿瘤转移密切相关,基础研究表明,血管内皮生长因子A(VEGF-A),或VEGF-A与胎盘生长因子(placental growth factor,PGF)形成的异二聚体(VEGF-A/PGF),均可激活VEGFR2,引起血管生成反应,最终促进恶性黑素瘤发生转移[39]。针对这一靶点,Chinnasamy等[40,41]设计了Anti-VEGFR2 CAR-T,并联合IL-2,在B16恶性黑素瘤小鼠模型中取得良好疗效,将生存期延长至对照组的2～3倍。但针对该靶点的CAR-T在Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT01218867)结果显示,招募的24例转移性恶性黑素瘤、肾癌患者接受治疗后,23例患者出现疾病进展,仅1例患者出现部分缓解,同时,约20%患者出现严重不良反应(肝功能损害、低氧血症)。为提高该CAR-T疗效,Lanitis等[42]提出利用VEGFR2单抗联合CAR-T治疗,在MM小鼠模型中,联合组抑瘤效果显著优于单用CAR-T组,肿瘤微环境分析显示,联合组中抑制性CAR-T比例减少,CAR-T展现出对肿瘤的持续杀伤能力,这也为未来临床试验治疗策略设计提供参考。目前对Anti-VEGFR2 CAR-T治疗有效率的提升仍需进一步研究,并控制相关毒副作用发生,以期取得更好的临床应用效果。

3.4 Anti-CD70 CAR-T CD70作为生物标志物高表达于恶性黑素瘤、脑胶质瘤等多个癌种,根据临床样本检测结果,CD70在原发性MM和转移性MM中表达率分别达到95%和37%[43],是CAR-T疗法的潜力靶点。Yang等[44]针对CD70靶点,设计了一种双靶点CAR-T,利用CAR结构中的Anti-CD70 scFv和Anti-B7-H3 scFv,同时靶向恶性黑素瘤细胞膜的CD70及B7-H3,在MM小鼠模型中,这种双靶点CAR-T比单靶点CAR-T展现出更强的抑瘤效应,也为后续以CD70为靶点的CAR-T研究提供思路,在靶向结合肿瘤细胞的基础上,利用共刺激分子进一步增强免疫反应,肿瘤靶向与免疫共刺激的双重效应,或成为未来CAR-T的重要研究方向之一。目前Anti-CD70 CAR-T已开展Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT02830724),在CD70阳性恶性黑素瘤中评价疗效及安全性,试验结果值得期待。

3.5 Anti-Gp100 CAR-T Gp100是恶性黑素瘤细胞最常见的过表达蛋白,阳性率超过60%,而在正常组织中低表达,其作为肿瘤抗原具有免疫原性,已有相关肿瘤疫苗研究,但在MM肿瘤免疫治疗中疗效有限,常需联合其他疗法控制肿瘤进展[45]。虽然Gp100为胞内蛋白,无法直接作为CAR-T靶点,但Zhang等[46]利用Gp100被递呈于细胞膜的抗原肽/HLA-A2复合物作为靶点,将特异性结合该复合物的TCR样抗体GPA7(TCR-like Antibody)作为CAR-T抗原识别区域,成功构建靶向MM胞膜递呈Gp100的CAR-T,体内外实验均显示该CAR-T可抑制Gp100阳性的MM肿瘤细胞生长,证实了递呈于胞膜的Gp100作为CAR-T靶点的可行性。以Gp100为靶点的CAR-T目前在招募6名Ⅳ期MM或复发性MM患者进行Ⅰ期临床试验(NCT03649529),以初步评估疗效及安全性。

3.6 Anti-NYESO-1 CAR-T NYESO-1是一种癌睾抗原(cancer-testis antigen),肿瘤特异性强,在恶性黑素瘤中表达率约为10%～15%[47,48],而在正常组织中仅睾丸组织表达,其余均不表达。NYESO-1作为细胞内抗原蛋白,以往工程化T细胞利用TCR-T对其递呈抗原进行识别结合并杀伤肿瘤细胞,而随着TCR样抗体的发展,已有针对NYESO-1递呈抗原/HLA复合物的scFv或mAb,并应用于CAR-T构建,使得Anti-NYESO-1 CAR-T在恶性黑素瘤中应用成为可能。Liu等[49]利用HLA-A2/NYESO-1 (抗原表位肽157-165)复合物为抗原制备scFv,并将该scFv应用于CAR-T构建,体内外试验显示,Anti-NYESO-1 CAR-T对阳性恶性黑素瘤细胞特异性杀伤,CAR-T分泌IFN-γ水平约为对照T细胞的10倍,CAR-T治疗组肿瘤体积仅为对照T细胞组的约1/3～1/2,动物实验疗效显著。以NYESO-1为靶点的CAR-T已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT03638206),招募NYESO-1阳性恶性黑素瘤患者,临床试验在进行中,凭借NYESO-1良好的肿瘤特异性,该CAR-T未来临床应用前景可期。

4 CAR-T疗法面临的挑战与机遇

尽管目前恶性黑素瘤的CAR-T治疗开展了数十项临床试验(表1),但公布试验结果的较少,大部分处于招募阶段,临床前研究取得的体内外良好疗效,能否在临床试验中取得成功仍是挑战。为进一步提高CAR-T疗效,一方面可联合免疫卡控点抑制剂,或在CAR-T中引入免疫共刺激信号,以增强工程T细胞活化增殖能力,并持续抗肿瘤活性[50];另一方面,利用肿瘤炎性反应,增强工程T细胞在肿瘤微环境的募集与浸润,克服免疫微环境抑制,也是发挥疗效的关键因素[51]。总体而言,CAR-T在MM中的临床应用仍然是机遇与挑战并存。

恶性黑素瘤的免疫微环境常呈抑制性状态,为使CAR-T充分在微环境浸润并激活抗肿瘤免疫应答,肿瘤细胞免疫原性死亡(immunogenic cell death,ICD)与免疫细胞的炎性浸润是重要环节[52]。Wang等[53]将CCR2、CCR4等趋化因子受体表达于CAR结构中,CAR-T在引起肿瘤细胞ICD同时,CAR-T细胞可进一步结合肿瘤微环境中释放的趋化因子,进而增强其在肿瘤组织的募集浸润,持续发挥抗肿瘤效应。此外,Evgin等[54]将含有干扰素基因的溶瘤病毒通过基因工程技术应用于CAR-T细胞构建,增强肿瘤组织的炎性反应,有效募集CAR-T浸润于肿瘤微环境发挥疗效。因此,提高ICD水平并增强CAR-T在肿瘤组织的浸润是未来提升CAR-T在恶性黑色素瘤中疗效的重要策略。

CAR-T在肿瘤免疫微环境中出现的PD-1及CTLA-4表达水平上调并发生T细胞耗竭,也是制约疗效的关键因素[55,56],针对PD-1/PD-L1等免疫抑制调控轴,除了联合使用免疫卡控点抑制剂等单抗药物,Rafiq[57]及Ping等[58]各构建了一种可分泌Anti-PD-1 scFv的多功能CAR-T,可通过旁分泌及自分泌形式产生scFv阻断PD-1免疫抑制信号通路,不仅增强CAR-T自身抗肿瘤活性,同时也产生“旁观者效应”,增强微环境中其他杀伤性T细胞的抗肿瘤活性,在实体瘤动物模型中取得良好疗效。此外,Anti-PD-L1 scFv分泌型CAR-T亦被成功构建并在临床前研究中证实可增强CAR-T对实体瘤疗效[59],未来该策略有望继续应用于CTLA-4、TIM3等scFv分泌型CAR-T构建,克服免疫抑制及T细胞耗竭的制约,提升CAR-T应用于恶性黑色素瘤的疗效。

除了阻断免疫卡控点信号通路,上调免疫共刺激信号也是增强CAR-T疗效的重要策略,例如T细胞表面的TIGIT分子(T cell Ig and ITIM domain),是T细胞免疫应答共刺激信号组成部分,但由于恶性黑色素瘤细胞表达的CD155可作为配体结合TIGIT而抑制T细胞免疫应答[60],因此Hoogi等[61]将CAR-T进一步基因改造后表达嵌合共刺激开关受体(chimeric costimulatory switch receptor,CSR),利用TIGIT 胞外结构域与CD28信号转导结构域融合表达作为CSR,发挥免疫信号共刺激开关分子作用,MM动物模型评价疗效发现,这种共刺激增强型CAR-T显著增强IFN-γ、TNF-α分泌,治疗组肿瘤体积缩小近50%,小鼠生存期亦显著延长。利用CSR增强CAR-T免疫反应杀伤肿瘤细胞或可为未来应用于MM的CAR-T设计提供参考。

5 结语

恶性黑素瘤在我国人群好发于肢端皮肤(例如足底、手指末端等)及黏膜部位(例如鼻腔与口咽黏膜等),因易发生远处转移,目前仍是皮肤肿瘤中预后最差的[62],致死率排名前列,采用传统手术、化疗、放射治疗或相互联合在进展期及转移性MM患者中并未取得理想疗效,因此综合抗肿瘤治疗是当前临床实践迫切需要的,包括CAR-T在内的免疫治疗是其中不可忽视的重要组成部分。尽管目前CAR-T疗法可能引起细胞因子风暴、神经毒性、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)、过敏反应等毒副作用,仍是未来需要改善和控制的重点,但CAR-T疗法经各类免疫增强策略优化后展现出的肿瘤杀伤能力仍是极具临床应用前景,也是目前MM免疫治疗所需要的重要力量。CAR-T细胞疗法在多项临床前研究中已展现出对恶性黑素瘤的良好抑瘤效果,并且CAR-T联合ICD药物、免疫卡控点抑制剂,以及scFv分泌型、免疫共刺激型等新型CAR-T的出现,进一步增强了在实体瘤中应用的疗效及安全性。目前针对转移性及难治性/复发性MM患者的多项CAR-T临床试验开展中,相信未来随着基因工程技术的发展及免疫微环境研究的深入,CAR-T疗法在恶性黑素瘤中将具有更广阔的应用前景。