银乐丸质量控制方法的研究

赵小伟,吴剑坤,王宏蕾,李洋,陈占功（毛克臣全国名老中医药专家传承工作室,首都医科大学附属北京中医医院,北京 100010）

银乐丸是北京中医医院皮肤科常用的院内制剂，具有活血解毒、润肤除湿的功效，用于瘀滞肌肤证的银屑病。银乐丸在北京中医医院皮肤科临床应用多年，对于银屑病有很好的治疗效果，但是没有较为完善的质量控制方法，本文应用现代手段，定性与定量相结合的方法，建立银乐丸质量控制的方法，保障临床用药安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260America Agilent HPLC色谱仪，超声清洗机（上海科导超声仪器有限公司），TD-Ⅱ型全自动薄层铺板机（上海科哲生化有限公司），XS205分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），Milli-Q纯水仪（MILLIPORE）。

1.2 试药 丹参对照药材（批号120923-200911）、芍药苷（批号110736-200934）、大黄素（批号756-9203）、当归对照药材（批号120927-200613）、丹参酮ⅡA对照品（批号110766-201520）、丹酚酸B对照品（批号110562-201514）；银乐丸（本院制剂室提供）。薄层板为硅胶G（青岛）；分析纯试剂（北京试剂公司）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 丹参的薄层色谱鉴别 取本品2袋（10g），研磨成细粉，加水50ml，充分搅拌后离心，将上清液以乙酸乙酯萃取2次，20ml/次，将乙酸乙酯液合并后蒸干，以甲醇1ml将残渣溶解，将其作为供试品标准溶液。另取丹参对照药材1.5g，加水20ml加热煎煮30min，放冷后过滤，续滤液用盐酸调整pH约为2，按照供试品溶液制备方法制备，可得到丹参对照药材溶液。依照中国药典2020年版一部附录薄层色谱鉴别法试验[1]，分别吸取5μl供试品溶液和对照药材溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）作为展开剂，展开后将其取出，晾干后喷3%三氯化铁乙醇溶液，以热风将其吹干。在色谱图中，供试品和对照药材斑点清晰。色谱结果见图1。

图1 银乐丸中丹参的薄层色谱鉴别图谱。①丹参阴性对照；②丹参对照药材；③-⑤供试品

2.1.2 赤芍、白芍的薄层色谱鉴别 将2.1.1中剩余的水层以水饱和正丁醇20ml萃取2次，将正丁醇溶液以30ml正丁醇饱和水洗涤1次，水浴蒸干正丁醇，以甲醇1ml将残渣溶解，将其作为供试品溶液。精密称定芍药苷对照品适量，用乙醇制备成1mg/ml的标准溶液。以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）的下层溶液作为展开剂，展开后晾干，喷5%香草醛硫酸溶液，加热直至斑点明显。在色谱图中，供试品和对照药材斑点清晰，色谱结果见图2。

图2 银乐丸中赤芍、白芍的薄层色谱鉴别图谱。①赤芍、白芍阴性对照；②⑥芍药苷对照品；③-⑤供试品

2.1.3 首乌藤的薄层色谱鉴别 将2.1.1中离心后的沉淀晾干，加入40ml乙醚，超声提取15分钟，过滤后蒸干滤液，以乙酸乙酯1ml将残渣溶解，作为供试品溶液。精密称定大黄素适量，用乙醇制备成0.2mg/ml的标准溶液。以石油醚（30℃-60℃）-甲酸乙酯-冰乙酸（15∶5∶1）为展开剂，晾干置365nm紫外光灯下观察。在色谱图中，供试品和对照品荧光斑点清晰；以氨蒸气熏后，斑点变为红色（大黄素），色谱结果见图3。

图3 银乐丸中首乌藤的薄层色谱鉴别图谱。①首乌藤阴性对照；②大黄素；③-⑤供试品

2.1.4 当归的薄层色谱鉴别 取当归对照药材0.5g，用20ml乙醚超声10分钟，以乙醇1ml将蒸干的滤液残渣溶解，作为对照药材溶液。以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，展开后将其取出，晾干后置365nm紫外光灯下观察。在色谱图中，供试品和对照药材荧光斑点清晰，色谱结果见图4。

图4 银乐丸中当归的薄层色谱鉴别图谱。①当归阴性对照；②当归对照药材；③-⑤供试品

2.2 丹酚酸B的含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验[1]流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78）；20℃的柱温；1.2ml/min的流速；286nm的检测波长。理论板数大于6000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B对照品，精密称量，加甲醇与水（8∶2）混合溶液，制备0.10mg/ml的溶液，即可。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末10g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50ml甲醇与水（8∶2）混合溶液，精密称量，超声0.5小时，放置常温后再精密称量，以甲醇与水（8∶2）混合溶液将其减少的重量补足，摇匀，精密量取5ml续滤液，加甲醇与水（8∶2）混合溶液定容至10ml容量瓶中，取续滤液，即可。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取不含丹参的处方中其他药材，以2.2.3相同的制备方法制备丹参阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别进样10μL。结果显示在该色谱条件下阴性对照无干扰，具有专属性。

式中：Nii，Hii以及Jii分别表示矩阵N，H，J的第i行第i列的元素；m为量测向量的维数；Fk+1为状态方程的jacobian矩阵；ωk+1为残差，η为遗忘因子，取值在0～1之间，通常取为0.95。

2.2.6 线性关系的考察 精密吸取0.1mg/ml的丹酚酸B对照品溶液，分别进样4、6、8、10、12、14μl，注入HPLC色谱仪，检测峰面积。纵坐标（Y）为峰面积积分值，横坐标（X）为进样量，求得回归方程为Y=799444X-3103.7，r=1.0000，丹酚酸B在0.1000-1.000μg范围内，进样量与丹酚酸B峰面积积分值线性关系良好。

2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取各10μl，每隔2小时进样一次，测定不同时间点的峰面积，记录8小时，峰面积RSD值为1.51%，结果显示样品在8小时内有良好的稳定性。

2.2.8 精密度试验 取同一丹酚酸B对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，计算其峰面积RSD为0.08%，结果显示仪器精密度良好。

2.2.9 重复性试验 取六份同一批号的样品，依照供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，进样10μl，计算峰面积RSD值为0.73%，结果显示重复性良好。

2.2.10 回收率试验 取已知含量的银乐丸6份，加入一定量的对照品溶液，按照2.3.3方法制备，结果见表1。

表1 银乐丸中丹酚酸B加样回收率检测结果

表2 银乐丸中丹酚酸B含量检测结果(mg/g)

2.3 丹参酮ⅡA的含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性[1]流动相A为乙腈，流动相B为磷酸溶液（0.02%），按药典方法进行梯度洗脱；20℃的柱温；270nm的检测波长。理论板数大于60000。

2.3.2 对照品溶液的制备 取丹参酮ⅡA对照品精密称量，放于棕色容量瓶中，加甲醇制备0.02mg/ml的溶液，即可。

2.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末10g，精密称量，置于具塞锥形瓶中，以50ml甲醇超声0.5小时，放置常温后再精密称量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，取续滤液，即可。

2.3.4 阴性对照溶液的制备 取不含丹参的处方中其他药材，以2.3.3相同的制备方法制备丹参阴性对照溶液。

2.3.5 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别进样10μL。结果显示在该色谱条件下阴性对照无干扰，具有专属性。

2.3.6 线性关系的考察 精密吸取0.02mg/ml的丹参酮ⅡA对照品溶液，进样4、6、8、10、12、14μl，注入HPLC色谱仪，检测峰面积。纵坐标（Y）为峰面积积分值，横坐标（X）为进样量，求得回归方程为Y=3411.7X-13.607，r=0.9999。说明丹参酮ⅡA在0.0800-0.2800μg范围内，进样量与丹参酮ⅡA峰面积积分值线性关系良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，精密吸取各10μl，在0、2、4、6、8小时分别进样，测定不同时间点的峰面积，计算峰面积RSD值为0.17%，结果显示样品在8小时内有良好的稳定性。

2.3.8 精密度试验 取同一丹参酮ⅡA对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，计算其峰面积RSD为0.26%，结果显示仪器精密度良好。

2.3.9 重复性试验 取6份同一批号的样品，依照供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，进样10μl，计算峰面积RSD值为0.17%，结果显示重复性良好。

2.3.10 回收率试验 取已知含量的银乐丸6份，加入一定量的对照品溶液（C=0.02mg/ml），按照2.3.3方法制备，结果见表3。

表3 银乐丸中丹参酮ⅡA加样回收率检测结果

2.3.11 样品测定 取银乐丸三批样品，各精密称定10g，按2.3.3项下方法制备三批供试品溶液，按照以上色谱条件分别进样10μl，记录峰面积，计算丹参酮ⅡA含量，结果见表4。

表4 银乐丸中丹参酮ⅡA的含量检测结果(mg/g)

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，皮损部分常伴有鳞屑性红斑，厚层鳞屑常比皮肤表面高，常有瘙痒症状[2]，具有病程较长、容易复发的特点[3]，银屑病病因复杂，目前还没有完全治愈的方法[4]。当前多用活性药物或生物制剂进行治疗，但副作用大，效果不理想，复发几率高，而传统中医药据有整体调节的特点，对银屑病的防治有着更大的优势[5]。“以血论治”在银屑病治疗中有着很高的共识度，是主要的辨证方法[6-9]。《赵炳南临床经验集》[10]收载了11例银屑病医案，赵炳南教授提出“银屑病发病的主要根据是血热”[11]。银屑病的基本证型有血热证、血瘀证、血燥证，分别采取凉血、活血、养血解毒的治疗方法，多项临床试验研究[12-17]证明了此辨证方法的有效性。

丹参为银乐丸的君药，常用于医治心脑血管疾病，还具有抑菌消炎等作用[18]。周静[19]等人研究发现，丹参主要成分为脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类成分，丹参酮ⅡA和丹酚酸B常作为丹参质量标准的主要测定成分[20]。故本文以银乐丸君药丹参中的主要成分丹酚酸B和丹参酮ⅡA作为含量测定指标。

银乐丸具有活血解毒、养血除湿的功效，临床用于治疗银屑病多年，疗效确切，但是未建立质量标准，本文采用现代研究手段对银乐丸进行质量提升，建立质量控制方法，方法简便易行，专属性良好，为临床用药提供质量保证。