超高效液相色谱-串联质谱法测定禽用饲料中苏丹红、罗丹明B和酸性橙II 等6 种染色剂含量

李 宏， 贺习文 ， 晁娟娟， 李 俊， 武治勇， 杨 森

（1.陕西省畜牧技术推广总站，陕西 西安 710016；2.陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，陕西 渭南 714000；3.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081；4.汉中市动物疫病预防控制中心，陕西 汉中 723000 ）

苏丹红是一种人工合成的工业染料，主要有苏丹红I、II、III、IV 四种。 苏丹红的成分中含有萘，该物质具有偶氮结构，此结构决定了苏丹红具有致癌性，且对肝肾器官具有很强的毒性作用（高敏国等，2023；周向丽，2022；张琴等，2021）。 国际癌症研究机构将苏丹红列为三类致癌物，其部分次级代谢产物被列为二级致癌物（栾庆祥等，2021）。 在我国苏丹红被禁止作为食品添加剂， 并相继出台了食品、化妆品、 饲料等基质中苏丹红的检测标准（GB/T29663 -2013，2013；NY/T 1258 -2007，2007；GB/T 19681-2005，2005）。 罗丹明B 又称玫瑰红B，是一种人工合成的染料，在老鼠试验中发现，罗丹明B会诱发皮下组织生肉瘤，被证实具有致癌性。 罗丹明B 在欧洲和我国都属于非法添加剂，除了具有致癌作用外，还具有损害眼睛、呼吸道、皮肤等危害，对人和动物的神经和生殖发育具有毒害作用（王伟霞等，2016；咸瑞卿等，2013）。酸性橙II 是一种化工染料，同时属于一种指示剂，用于组织切片的染色。酸性橙II 属于非食用色素，食品中禁止添加，人食用后会引起食物中毒，长期食用会致癌（邹康平等，2021；赵智锋等，2013；曾泳艇等，2012）。

苏丹红、 罗丹明B 和酸性橙II 具有色泽鲜艳、着色力强、价格低廉等特点，一些不法商贩将这些染色剂非法加入食品、 蛋糕、 辣椒面等商品中，通过提高色泽牟利。而将这些染色剂添加在禽用饲料中，会在禽类动物体内富集，使其产下的蛋中蛋黄呈现红色而吸引消费者（刘宁等，2006）。由于这类染色剂对人体会造成极大的危害， 因此建立禽用饲料中苏丹红、罗丹明B 和酸性橙II 的检测方法很有必要。

目前，检测苏丹红、罗丹明B 和酸性橙II 的方法主要有高效液相色谱法（朱洁灵等，2022；陈洁，2021；曹涛等，2013）、分光光度法（王群，2014；占达东等，2006）、液相色谱-串联质谱法（曹美萍等，2021；梁伟龙等，2020；李首道等，2019），其中分光光度法的相关报道较少，且检出限较高，适用性较差。高效液相色谱法具有操作简单，使用成本低等特点， 但同样具有灵敏度低， 易受干扰等缺点。 本研究采用UPLC-MS/MS 法，具有定性准确，灵敏度高，检测效率高等优点。 此外，已有的报道显示，有能够同时测定苏丹红、罗丹明B 和酸性橙II 的检测方法，但多集中在肉制品、辣椒类调味品中（刘翰升，2016；林清荷，2014；张剑锋等，2013）， 鲜见同时测定饲料中此6 种物质的UPLC-MS/MS 法的报道，本研究考察了饲料基质中6 种染色剂的提取、净化和基质效应等，旨在建立高效准确的UPLC-MS/MS 方法，为饲料中这类染色剂的监督检验提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及材料 Ultimate 3000 型高效液相色谱系统 （Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；TSQ Quantiva 三重四级杆质谱仪（Thermo Fisher Scientific 公司， 美国）；H1850 型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；MS205DU型十万分之一天平 （Mettler Toledo 公司）；CP224C 型； 万分之一天平 （奥豪斯仪器有限公司，常州）；MX-S 型涡旋混合仪（大龙兴创仪器股份有限公司， 北京）；SHZ-C 型往返式振荡器（上海博讯）；MTN-4800A 型氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV 标准物质采购自Dr.Ehrenstorfer 公司，纯度＞97.0%；罗丹明B、酸性橙II 采购自坛墨质检标准物质中心，纯度＞98.0%；乙腈（色谱纯，美国Sigma 公司）；正己烷（色谱纯，Oceanpak 公司）；乙酸乙酯（色谱纯，Oceanpak 公司）；甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

ALN 固相萃取柱（中性氧化铝填料）和C18固相萃取柱：200 mg/6 mL， 月旭科技有限公司；C18净化材料（40 ～60 μm）：月旭科技有限公司；PSA 净化材料（40 ～63 μm）：PuReagent Chemicals Inc 公司；中性氧化铝净化材料（40 ～60 μm）：月旭科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制 标准储备液的配制：分别称取6 种标准品1 mg 于10 mL 容量瓶中， 用乙腈溶解并定容至刻度， 配制成浓度为100 μg/mL的标准储备液。

混合标准中间溶液的配制： 准确吸取苏丹红I、II、III、IV 和酸性橙II 标准储备液各0.1 mL，罗丹明B 标准储备液0.01 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度， 配制成苏丹红I、II、III、IV 和酸性橙II 浓度为1 μg/mL， 罗丹明B 浓度为0.1 μg/mL 的混合标准中间溶液。

标准工作溶液的配制： 吸取适量混合标准中间溶液， 用乙腈配制成苏丹红I、II、III、IV 和酸性橙II 浓度分别为2、5、10、50、100 ng/mL， 罗丹明B 浓度分别为0.2、0.5、1、5、10 ng/mL 系列标准工作溶液，备用。

1.3 前处理方法 提取： 称取2.5 g （精确至0.0001 g）试样于50 mL 离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋1 min， 置于振荡器上振荡提取10 min，7000 r/min 离心3 min，将上清液倒入另一离心管中，作为备用液。

净化：取3 mL 备用液于10 mL 离心管中，依次加入100 mg C18净化材料和100 mg PSA 净化材料，涡旋1 min，静置10 min，上清液过0.22 μm滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 检测条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm；柱温：40 ℃；流动相：A 为10 mmol/L的乙酸铵溶液，B 为乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脱程序：0 ～5 min，10%B ～90%B；5 ～8 min，90%B；8 ～8.1 min，90%B ～10%B；8.1 ～10 min，10%B；进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式： 正、 负离子扫描； 监测方式： 多反应检测（MRM）；喷雾电压：正离子模式3500 V，负离子模式2500V； 鞘气压力：35 Arb； 辅助气压力：10 Arb；传输管温度：350 ℃；雾化器温度：350 ℃；各待测物质谱参数见表1。

表1 目标化合物的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 提取溶液的考察 苏丹红不溶于水，易溶于乙腈、正己烷等有机试剂；罗丹明B 和酸性橙II易溶于水和乙醇等有机试剂。据此物理性质，优先考虑甲醇、乙腈、正己烷和乙酸乙酯作为提取液，按照1.3 中的前处理过程对四种有机试剂进行考察，选取某鸡用预混料进行加标试验，其中甲醇、乙腈提取液净化后直接上机测试， 正己烷和乙酸乙酯经氮气吹干后用甲醇或乙腈复溶净化后上机测试。试验结果表明，乙腈作为提取液时回收率最高，6 种化合物均能达到90%以上（图1）。

图1 不同提取溶剂的添加回收率

再考察乙腈、0.1%甲酸乙腈和乙腈-水溶液的提取效果，结果发现乙腈中引入甲酸后，酸性橙II 的回收率降低；采用乙腈-水溶液作为提取溶液时，四种苏丹红的回收率明显降低，综合考虑采用乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化方式的选择 已有报道采用ALN 固相萃取柱对辣椒及其制品中苏丹红提取溶液进行净化（詹克航等，2013），以及采用C18固相萃取柱对辣椒制品中苏丹红提取溶液净化（王韦岗等，2017）。本研究测试了ALN 固相萃取柱和C18固相萃取柱在饲料中的净化效果， 并未达到理想的净化效果，其中C18柱需要将乙腈溶剂浓缩转换为水相溶剂后进行净化，6 种染料的回收率均大幅降低。

因此， 本研究考察了直接加入净化材料吸附杂质的方式净化， 向净化液中加入C18和PSA 两种净化材料，得到了很好的净化效果，在保证回收率不受影响的同时，大幅缩短了净化时间，提高了工作效率（图2 ～图4）。

图2 未净化的加标样品总离子流图

图3 ALN 固相萃取柱净化的加标样品总离子流图

图4 C18+PSA 净化的加标样品总离子流图

2.3 净化材料的选择 试验分别考察了C18、PSA和ALN 三种净化材料的净化效果， 结果表明，C18净化材料能够净化罗丹明B 色谱峰附近的杂质峰，PSA 能够有效净化苏丹红III、IV 色谱峰附近的杂质峰，ALN 则没有明显的净化效果。 因此选用C18+PSA 的组合材料进行净化。

试验考察了不同质量C18和PSA 的净化效果，结果表明，当两种吸附材料各称取100 mg 时，净化效果最佳， 称取超过100 mg 时无明显变化，考虑到净化材料较为昂贵，为了节省成本，将两种材料的质量均定为100 mg。

2.4 色谱柱的考察 本研究采用Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm 和Hypersil GOLD C18100 mm×2.1 mm，1.9 μm 共2 款色谱柱进行测试。结果表明Hypersil GOLD C18100 mm×2.1 mm，1.9 μm的色谱柱出峰时间长， 难以体现UPLC 快速分离的优势，Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm的色谱柱分离时间适中， 且对四种苏丹红可以达到良好分离， 因此本试验选用Hypersil GOLD C1850 mm×2.1 mm，1.9 μm 规格的C18色谱柱。

2.5 流动相的考察 由于同时采用正、负离子两种扫描模式，因此考虑水相使用0.1%甲酸溶液和10 mmol/L 乙酸铵溶液两种，试验结果表明，0.1%甲酸溶液对酸性橙II 的灵敏度有抑制效果，10 mmol/L乙酸铵溶液对6 种化合物均有较好的灵敏度。

有机相常用的有甲醇或乙腈， 采用甲醇作为有机相时，由于提取溶剂为乙腈，进样时由于两种溶剂极性的差异，产生了较强的溶剂效应，其中酸性橙II 出现分叉现象，苏丹红III、IV 出现不同程度的拖尾现象，将有机相换成乙腈时，溶剂效应随之消失，因此流动相选用10 mmol/L 乙酸铵+乙腈进行梯度洗脱。 6 种化合物及MRM 图见图5。

图5 6 种化合物MRM 图

2.6 柱温度的考察 试验考察了柱温度分别为25、30、35、40 ℃和45 ℃时对目标化合物出峰时间和峰型的影响， 试验结果表明， 柱温度越高，6种化合物出峰时间越短， 当柱温度设置为40 ℃时，6 种化合物均能保证在10 min 内出峰， 考虑到柱温箱的使用寿命，将柱温定为40 ℃。

2.7 洗脱方式的选择 由于四种苏丹红不溶于水的特性，采用等度洗脱时，需采用大比例的有机相进行洗脱， 这会造成酸性橙II 出峰时间过快，无法在色谱柱上有效保留。 采用梯度洗脱的方式， 洗脱四种苏丹红时逐渐增加有机相比例，从而达到很好的分离效果。图6 为6 种化合物标准总离子流图。

图6 6 种化合物标准总离子流图

2.8 质谱条件的优化 将混合标准中间液注入质谱仪，对目标化合物进行一级质谱全扫描（Full Scan），在正、负离子扫描模式下，通过调节碰撞气的大小，确认目标化合物的母离子（m/z）后进行二级质谱的参数优化。

通过调节碰撞能量、鞘气和辅助气等参数，调节碰撞能量的大小， 找出最大且稳定的碎片离子作为定量离子， 选取响应值较大且稳定的碎片离子作为定性离子。 同时优化出最佳的锥孔电压等质谱参数。 具体数据见表1。

2.9 基质效应考察及方法线性范围 本研究考察了6 种化合物在不同基质的饲料中所产生的基质效应， 通过向空白饲料样品中添加标准溶液的方式，计算出各组分的添加回收率。试验选用了禽类动物常用的配合饲料、 蛋白质补充饲料和预混合饲料， 试验表明，6 种化合物回收率均达到了90%以上，受基质效应影响很小，因此不考虑采用基质匹配标准曲线。

将混合标准中间溶液用乙腈稀释成系列标准工作液，以浓度作为横坐标，各组分峰面积作为纵坐标建立标准曲线，结果表明，各浓度与质谱响应值间存在较好的线性关系， 相关系数R2均大于0.999，具体数据见表2。

表2 6 种药物的线性范围、线性方程和相关系数

2.10 方法灵敏度、 准确度和精密度 选取空白饲料样品，添加适量混合标准溶液，按前处理步骤处理后上机测定，依据信噪比S/N＞3（按PtP 算）作为检出限（LOD），依据信噪比S/N＞10（按PtP算）作为定量限（LOQ），确定本方法在饲料中苏丹红I、II、III、IV、 酸性橙II 检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg；罗丹明B 检出限为0.05 μg/kg，定量限为0.1 μg/kg。

通过向空白样品中加标的方式验证方法的回收率和精密度，选用空白禽用配合饲料、蛋白质补充饲料和预混合饲料各6 份， 在样品中添加6 种化合物标准溶液（3 个不同浓度，每个浓度6 个平行），进行加标回收实验，结果表明，方法回收率为90% ～110%，相对标准偏差＜10%，证明该方法在不同禽用饲料中检测6 种化合物均有较好的准确度和精密度。 结果见表3。

表3 6 种化合物的添加浓度、回收率及精密度

2.11 实际样品的测定 抽取了禽用配合饲料、蛋白质补充饲料和预混合饲料各20 批进行了检测，结果显示，所抽检的60 批样品中，2 份样品中检出苏丹红III，分别为2.75 μg/kg 和11.2 μg/kg，其余化合物均未检出。

3 结论

本研究基于UPLC-MS/MS 结合QuEChERS快速净化方式， 建立了一种测定禽用饲料中6 种化工染料的定量分析方法。经过实验证明，本方法具有良好的稳定性和重复性，且方法灵敏度高，具有较低的检出限和定量限，同时具有快速、准确、成本低廉等优点。 该方法满足禽用饲料中苏丹红等6 种化工染料的分析要求， 为禽用饲料的质量安全提供技术保障。