人参皂苷Rb1通过激活AMPK减轻大鼠创伤性骨关节炎

康飞科,孙 强,陈永锋,漆 伟,王远瑞

(空军军医大学第一附属医院骨科,西安 710032;*通讯作者,E-mail：531890893@qq.com)

创伤后骨关节炎(post-traumatic osteoarthritis, PTOA)是骨关节炎(osteoarthritis, OA)的一种亚型,占所有OA病例的近12%[1],并且多发于年轻人[2]。可能导致PTOA的危险因素包括前十字韧带(anterior cruciate ligament, ACL)损伤、半月板撕裂、盂肱关节不稳定、髌骨脱位和踝关节不稳定[3]。在这些危险因素中,ACL损伤的发生率最高[4]。另外,许多ACL损伤膝盖伴有半月板损伤[5]。目前,临床中缺乏PTOA的有效治疗方法。人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,G-Rb1)是人参属植物中富含的皂甙成分之一,具有多种活性[6-8]。现有文献证明,G-Rb1可防止骨软骨破坏[9],促进骨形成[10],预防股骨头缺血性坏死[11]。另外,G-Rb1可以减轻OA大鼠的软骨损伤和变性[12]。然而,目前尚不清楚G-Rb1治疗PTOA的机制。AMP活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)是一种主要的能量传感器,调节细胞能量平衡[13]。此外,AMPK激活通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路对软骨细胞具有抗炎作用[14]。OA中炎症细胞因子升高会导致软骨细胞中AMPK去磷酸化和抑制[15]。目前,AMPK在软骨细胞能量稳态和炎症调节中的关键作用使其成为OA的潜在治疗靶点[16]。多项文献表明G-Rb1是AMPK的激活剂[17-19]。因此,本研究从AMPK活化的角度探讨了G-Rb1对PTOA大鼠模型的治疗作用,旨在揭示G-Rb1治疗PTOA的效果和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

80只雄性SD大鼠(7～8周龄,270～330 g)由空军军医大学第二附属医院骨科实验室提供,大鼠在屏障环境(25 ℃、55%湿度、12 h光/12 h暗循环照明)中饲养。

1.2 实验试剂

人参皂苷Rb1(货号：WKQ-0000463,纯度≥98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司。AMPK抑制剂Compound C(货号：HY-13418A,纯度99.91%)购自美国MCE公司。白介素-1β(IL-1β)(货号：SEKR-0002)、IL-6(货号：SEKR-0005)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(货号：SEKR-0009)ELISA试剂盒、苏木素伊红(HE)染色试剂盒(货号：G1120)、改良番红O/固绿软骨染色试剂盒(货号：G1371)、TUNEL细胞凋亡试剂盒(绿色荧光)(货号：T2196)均购自北京索莱宝科技有限公司。PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(货号：RR047A)、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(货号：RR820A)购自日本TaKaRa公司。p-AMPKα(Thr172)(货号：AF3423)、AMPKα(货号：AF6423)和GAPDH(货号：AF7021)一抗、IgG(H+L)HRP二抗(货号：S0001)均购自美国Affinity公司。

1.3 PTOA大鼠建模

采用前十字韧带切断加半月板部分切除法建立PTOA大鼠模型[20]。大鼠经异氟醚吸入麻醉后仰卧固定于手术台,髌骨外侧做切口,暴露右膝关节腔,切断前交叉韧带并切除1/3内侧半月板,然后缝合切口并消毒。

1.4 实验分组和药物处理

将大鼠分为假手术组、模型组、低、中、高剂量组和抑制剂组(每组12只)。假手术组大鼠切开髌骨外侧皮肤后立即缝合伤口,其余4组均为PTOA模型大鼠。建模完成2 h后,假手术组和模型组大鼠灌胃2 mL生理盐水。低、中、高剂量组大鼠分别灌胃2 mL浓度为10,20,40 mg/(kg·d)的G-Rb1溶液[21,22]。抑制剂组大鼠灌胃2 mL浓度为40 mg/(kg·d)的G-Rb1溶液,同时腹腔注射20 mg/(kg·d)的AMPK抑制剂Compound C[23]。各组大鼠均处理4周。

1.5 组织学染色检测软骨组织病理变化

给药处理结束后,各组大鼠异氟醚吸入麻醉,采集大鼠腹主动脉血冻存备用,然后处死大鼠并分离大鼠膝关节和软骨组织备用。采用4%多聚甲醛固定大鼠膝关节处理24 h,再用0.5 mol/L的EDTA溶液4 ℃下脱钙处理2周,然后常规制作5 μm厚石蜡切片。59 ℃烘烤切片30 min,再经过脱蜡和水化处理后,按照试剂盒说明,采用HE染色评价关节软骨形态;采用番红O/固绿染色法评价关节软骨退变,然后进行国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)评分(0～24分,分值越高,表明软骨退变越严重)[24];采用TUNEL染色检测软骨细胞凋亡。

1.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症因子

已采集的各组大鼠腹主动脉血经过离心后收集上层血清,通过ELISA测定大鼠血清样品中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.7 定量逆转录PCR(RT-qPCR)检测软骨组织中细胞凋亡、软骨降解和骨形成相关基因的转录水平

表1 引物序列

1.8 蛋白质免疫印迹(Western blot)检测软骨组织中p-AMPKα(Thr172)和AMPKα的蛋白表达水平

使用RIPA提取软骨总蛋白,BCA法进行蛋白定量,采用12% SDS-PAGE分离蛋白并转移到PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,将膜与1∶1 000稀释的p-AMPKα(Thr172)、AMPKα和GAPDH(内参蛋白)一抗于4 ℃孵育过夜。然后将膜与1∶1 000稀释的IgG(H+L)HRP二抗室温孵育2 h。ECL显影。ImageJ软件定量条带灰度值,结果表示为p-AMPKα与AMPKα蛋白条带灰度值的比值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 G-Rb1对PTOA大鼠软骨形态和软骨退变的影响

HE染色和番红O/固绿染色显示,假手术组大鼠膝关节软骨正常;模型组大鼠软骨层变薄,表面粗糙不光滑,软骨细胞数量减少,细胞核固缩、坏死,番红O染色浅;与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠的软骨形态呈G-Rb1剂量依赖性明显改善,番红O染色加深;与高剂量组比较,抑制剂组大鼠的软骨损伤加重,番红O染色浅(见图1)。与假手术组比较,模型组大鼠的OARSI评分升高(P<0.05)。与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠的OARSI评分降低(P<0.05)。与高剂量组比较,抑制剂组大鼠的OARSI评分升高(P<0.05,见图1)。

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与高剂量组比较,&P<0.05。图1 G-Rb1对PTOA大鼠软骨形态和软骨退变的影响 (×400)Figure 1 Effects of G-Rb1 on cartilage morphology and cartilage degeneration in PTOA rats (×400)

2.2 G-Rb1对PTOA大鼠软骨细胞凋亡的影响

与假手术组比较,模型组大鼠的软骨细胞TUNEL阳性率和Bax mRNA相对表达量升高,Bcl-2 mRNA相对表达量降低(均P<0.05,见图2)。与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠的软骨细胞TUNEL阳性率和Bax mRNA相对表达量剂量依赖性降低,Bcl-2 mRNA相对表达量升高(均P<0.05,见图2)。与高剂量组比较,抑制剂组大鼠的软骨细胞TUNEL阳性率和Bax mRNA相对表达量升高,Bcl-2 mRNA相对表达量降低(均P<0.05,见图2)。

2.3 G-Rb1对PTOA大鼠血清炎症因子的影响

与假手术组比较,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高(P<0.05);与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均剂量依赖性降低(P<0.05);与高剂量组比较,抑制剂组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高(均P<0.05,见表2)。

表2 G-Rb1对PTOA大鼠血清炎症因子的影响 (pg/mL)

2.4 G-Rb1对PTOA大鼠软骨基质降解的影响

与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中Collagen Ⅱ mRNA相对表达量降低,MMP-13 mRNA相对表达量升高(均P<0.05,见图3)。与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠软骨组织中Collagen Ⅱ mRNA相对表达量均剂量依赖性升高,MMP-13 mRNA相对表达量均剂量依赖性降低(均P<0.05,见图3)。与高剂量组比较,抑制剂组大鼠软骨组织中Collagen Ⅱ mRNA相对表达量降低,MMP-13 mRNA相对表达量升高(均P<0.05,见图3)。

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与高剂量组比较,&P<0.05。图3 G-Rb1对PTOA大鼠软骨基质降解的影响Figure 3 Effect of G-Rb1 on the degradation of cartilage matrix in PTOA rats

2.5 G-Rb1对PTOA大鼠软骨形成的影响

与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中Runx2和BMP-2 mRNA相对表达量均降低(P<0.05);与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠软骨组织中Runx2和BMP-2 mRNA相对表达量均剂量依赖性升高(P<0.05);与高剂量组比较,抑制剂组大鼠软骨组织中Runx2和BMP-2 mRNA相对表达量均降低(均P<0.05,见图4)。

注：与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与高剂量组比较,&P<0.05。图4 G-Rb1对PTOA大鼠软骨形成的影响Figure 4 Effect of G-Rb1 on chondrogenesis in PTOA rats

2.6 G-Rb1对PTOA大鼠软骨AMPK磷酸化的影响

与假手术组比较,模型组大鼠软骨中AMPKα相对磷酸化水平降低(P<0.05);与模型组比较,低、中和高剂量组大鼠软骨中AMPKα相对磷酸化水平均剂量依赖性升高(P<0.05);与高剂量组比较,抑制剂组大鼠软骨中AMPKα相对磷酸化水平降低(P<0.05,见图5)。

3 讨论

目前,文献中讨论最多的PTOA治疗方法包括抗细胞因子和趋化因子治疗(关节内注射IL-1Ra)[4]、抗再吸收治疗(双膦酸盐和雷奈酸锶等)[25]等。然而,临床中仍缺乏有效的PTOA治疗方法,因此,探索PTOA的新型疗法具有重要意义。ACL和半月板损伤是导致PTOA的主要危险因素,ACL损伤后发生PTOA的发生率高达87%[4]。另外,许多ACL损伤膝盖伴有半月板损伤[5],与单纯ACL损伤的患者相比,半月板撕裂的患者更容易发生PTOA[26]。半月板损伤后会合成各种可溶性酶和炎症介质以应对创伤,从而加速邻近软骨的降解[2]。因此,本研究采用ACL切断加半月板部分切除法建立PTOA大鼠模型。目前,针对软骨损伤和细胞凋亡的干预措施是治疗PTOA的重点方向,几乎一半的ACL损伤患者伴有股骨内侧髁和外侧髁的关节软骨损伤[2]。机械冲击会对关节软骨造成严重损伤,引发软骨细胞坏死和凋亡[27],同时也会导致软骨细胞基质降解酶和炎症细胞因子表达增加,进而导致软骨细胞凋亡[3]。由于软骨的愈合能力较差,关节软骨表面的损伤可能直接导致PTOA的发生[4]。其他文献报道,G-Rb1可下调兔膝关节凋亡标记物Caspase-3和Bax的表达,具有抗凋亡作用[9]。在本研究中,G-Rb1改善了PTOA大鼠软骨形态,减轻了软骨退变,并且抑制了软骨细胞凋亡。表明G-Rb1可能通过抑制软骨细胞凋亡减轻PTOA软骨损伤。

在最初ACL创伤后,各种炎症细胞因子大量产生会扰乱关节内的稳态,导致关节退化[2]。例如,IL-6和IL-17与IL-1β协同作用,加速软骨细胞外基质(ECM)的降解。IL-1β、TNF-α和IL-6水平升高与润滑素水平降低相关,润滑素为关节软骨提供抗粘连和软骨保护特性,ACL损伤后滑液润滑素的减少会增加ECM降解的风险[28]。据报道,G-Rb1在OA大鼠模型中也表现出了抗炎作用,可以降低IL-1β水平[12]。本研究观察到G-Rb1降低了PTOA大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。推测,G-Rb1缓解PTOA进展的机制可能与其抗炎作用有关。

损伤过程中软骨细胞基因表达的改变和各种降解酶(例如MMPs)的激活会导致进行性软骨损失[3]。MMP水平升高会导致包括蛋白聚糖和胶原蛋白在内的关节ECM降解,并引发MMP进一步激活,从而形成正反馈循环[3]。选择性抑制MMP会减少关节软骨ECM的降解[2]。文献报道,G-Rb1通过预防软骨降解抑制绝经后大鼠单碘乙酸盐诱导的OA[29]。G-Rb1可以降低OA大鼠MMP-13水平,减轻软骨损伤和变性,并在体外抑制IL-1β诱导的软骨细胞中MMP-13的表达[12]。本研究观察到G-Rb1升高了PTOA大鼠软骨Collagen Ⅱ基因转录水平,降低了MMP-13基因转录水平。因此,G-Rb1可能通过调节PTOA大鼠软骨中Collagen Ⅱ和MMP-13的转录活性,进而抑制软骨降解。此外,文献报道,G-Rb1显著上调股骨头缺血性坏死大鼠Runx2和BMP-2蛋白的表达[11]。本研究观察到G-Rb1升高了PTOA大鼠软骨Runx2和BMP-2基因转录水平。因此,G-Rb1对PTOA的保护作用可能与促进软骨形成有关。

已有研究证实异常的AMPK活性与OA有关[16]。在正常关节软骨细胞中AMPKα表现为强磷酸化。然而,与正常组织相比,OA患者和动物模型的关节软骨中时AMPKα的Thr172位点磷酸化显著降低[30]。在用炎性细胞因子和机械损伤处理的软骨细胞中,AMPK活性受到抑制,沉默软骨细胞中的AMPK会加剧IL-1β和TNF-α的分解代谢反应[15]。这些数据表明AMPK活性对于维持软骨稳态和软骨细胞活性是不可或缺的。此外,激活AMPK可以减少炎症并阻止OA进展。例如,选择性AMPK激动剂AICAR显著抑制软骨细胞对炎症细胞因子的分解代谢反应[15]。在体内,Li等[31]证明关节内注射二甲双胍可改善内侧半月板不稳定的小鼠膝关节破坏的严重程度,然而AMPKα基因缺失减弱了二甲双胍对OA的保护作用。文献报道G-Rb1是一种AMPK激活剂,G-Rb1通过激活AMPK途径减少H2O2诱导的人脐静脉血管内皮细胞功能障碍[32]。G-Rb1通过磷酸化AMPK改善糖尿病动脉硬化[33]。G-Rb1通过激活AMPK改善细胞自噬,从而提高缺氧心肌细胞的生存能力[34]。本研究观察到G-Rb1升高了PTOA大鼠软骨AMPKα磷酸化水平,激活了AMPK。这些结果提示G-Rb1减轻大鼠PTOA的作用机制与激活AMPK密切相关。此外,本研究使用G-Rb1和AMPK抑制剂Compound C同时处理PTOA大鼠,结果表明抑制AMPK的激活减弱了G-Rb1对PTOA大鼠的治疗作用,表明G-Rb1通过激活AMPK减轻大鼠PTOA。

综上所述,本研究表明G-Rb1通过激活AMPK减轻大鼠PTOA。G-Rb1是一种临床治疗PTOA的候选天然药物,而AMPK是治疗PTOA的潜在靶标。本研究有以下局限性：首先,虽然本研究明确了G-Rb1治疗PTOA大鼠的效果,但是未与其他药物做比较,无法确定G-Rb1在治疗PTOA方面是否优于其他药物。其次,本研究应用G-Rb1治疗PTOA大鼠4周的疗程中未发现明显不良反应,但尚不清楚该药物是否具有远期毒副作用。最后,本研究是一项基于动物模型的实验研究,G-Rb1治疗PTOA的临床效果还需进一步研究。因此,本课题组将在今后研究中进一步将G-Rb1与其他治疗PTOA的常见药物做疗效比较,明确G-Rb1的临床开发价值。另外,本课题组将进一步扩大研究周期,深入探讨G-Rb1治疗PTOA的有效性和安全性,为其临床应用打下基础。