2012—2022年针灸治疗心肌缺血再灌注损伤的动物实验分析*

刘琼琼,嵇 波,葛云鹏,谢亚娜,方 洋,王佳佳,石天宇,刘翼天

(北京中医药大学针灸推拿学院,北京 100029)

心血管疾病是导致患者死亡的重要原因之一,其中心肌缺血是引起心血管疾病最常见的原因。长时间心肌缺血缺氧会造成心肌不可逆转的损伤,影响心功能。随着现代医学的进步,通过经皮冠状动脉支架术、溶栓疗法等技术可以恢复心肌血供、降低心肌损伤和病死率。然而,在再灌注过程中心肌细胞产生炎症反应、脂质过氧化物增加等原因会产生大量自由基,这些自由基攻击再灌注组织内的细胞,可对心肌造成进一步损伤,甚至导致心律失常等一系列严重的临床后果,称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。有研究显示,每年缺血性心脏病患者都在增多,2017年,中国大陆进行了228 938例心脏手术[1]。这些患者在心脏缺血-复流过程中均会产生再灌注损伤,因此MIRI的防治是心血管领域研究的热点。现代医学多使用维生素E、钠-钙交换阻断剂等药物或缺血预处理的手段防治MIRI。但药物应用疗效不确定,在临床上尚未完全开展,有待进一步的研究和验证;预处理也存在缺血现象不可预见、操作不及时等缺点。近年来,针灸治疗MIRI的实验取得了大量成果,但其干预措施、作用效果、治疗机制等内容并没有一个系统的归纳,因此,本文对近10年来针灸防治MIRI的实验成果进行汇总分析,以期对以后的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 文献来源

查阅2012年1月1日—2022年6月1日期间中国知网、维普、万方、CBM、PubMed和Web of Science数据库发表的文献。中文检索词“心肌缺血再灌注”“再灌注心肌”“针灸”“针刺”“艾灸”“灸”“温针灸”“电针”“耳针”“头针”“腹针”,英文检索词“Myocardial Reperfusion Injury”“Myocardial Reperfusion Injury”“Injuries, Myocardial Reperfusion”“Myocardial Reperfusion Injuries”“Reperfusion Injuries, Myocardial”“Myocardial Ischemic Reperfusion Injury”“Reperfusion Injury, Myocardial”“Injury, Myocardial Reperfusion”“Acupuncture”“Pharmacopuncture”“electroacupuncture”“Moxibustion”。

1.2 文献纳入标准

研究类型为随机对照研究的文献;研究对象为动物模型的文献;干预措施包括单纯针刺、电针、艾灸、温针灸等穴位刺激方式的文献。

1.3 文献排除标准

重复发表的、未获得全文的或文章内容不全的文献;综述、系统评价和meta分析、会议论文;文章数据不明确或统计方法有误的文献。

1.4 文献数据处理

按照上述检索策略将符合条件的文献导入EndNote20文献管理系统,运用软件剔除重复文献,然后通过题目和摘要进行初筛,再进一步阅读全文判断是否符合纳入标准,并提取纳入文献的实验动物、造模方法、干预组措施、对照组措施和结局指标等相关信息,运用Excel软件进行总结归纳。

2 结果

2.1 文献筛选结果

根据检索策略,检出中文文献529篇、英文文献64篇,剔除重复文献后剩余中文文献161篇、英文文献30篇,通过阅读文章,最终检出符合要求的文献164篇,其中中文文献138篇,英文文献26篇。

2.2 年度分布情况

如图1所示,筛选的文献数量随分布年限基本呈上升趋势,近5年较之前明显增多且呈波动状态,2019年达到高峰(n=24),2020年有下降趋势(n=14),2021年又有回升(n=20)。

图1 2012年1月1日—2022年6月1日针灸防治MIRI动物实验的文献数量变化图

2.3 纳入研究的基本情况

2.3.1 实验对象的选择 纳入文献所选用的实验动物有SD大鼠(n=71)、wistar大鼠(n=66)、C57/BL6小鼠(n=6)、ZDF大鼠(n=2)、新西兰大耳白兔(n=15)和健康家兔(n=3)。另有一篇文献中用Stat5-floxed小鼠和Tnnt2-Cre小鼠杂交出Stat5-cKO小鼠,后使用Stat5-floxed小鼠和杂交出的Stat5-cKO小鼠进行试验[2]。关于实验动物性别,实验小鼠多为雄性(n=106),新西兰大耳白兔多雌雄不限(n=12)。在实验动物年龄方面,未标明年龄的文献有105篇;新西兰大耳白兔多3～4月龄(n=11);SD大鼠年龄最小为3～4周龄,最大为18～24月龄,其余多在2～4月龄之间;wistar大鼠常见42～48日龄(n=6)、3月龄(n=8)。关于实验动物体质量,新西兰大耳白兔多为1.5～2.5 kg(n=12);Wistar大鼠大多在180～300 g之间;SD大鼠的体质量最小为50～70 g,最大为500～600 g,其余大多在200～350 g之间,见表1。

表1 近10年针灸防治MIRI动物实验所用实验动物品系、性别、年龄、体质量和造模的基本情况

2.3.2 模型制备的方法 判断造模成功的标准为心电图和(或)形态学改变[3]:缺血时肢体Ⅱ导联ST段弓背上抬、T波高耸,再灌注后ST段回落1/2以上;心脏苍白或紫绀提示心肌缺血形成,再灌注后苍白或紫绀区变红提示再灌注成功。纳入的文献中SD大鼠造模常见搭配是缺血40 min再灌注60 min(n=14);其次是缺血30 min再灌注240 min(n=10)和缺血30 min再灌注120 min(n=10)。Wistar大鼠最多的造模方法是缺血20 min再灌注40 min(n=17)。新西兰大耳白兔常见造模时间为缺血40 min再灌注60 min(n=10),见表1。

2.3.3 针灸干预方案

2.3.3.1 干预措施 针灸对MIRI的干预措施主要有电针、艾灸等,其中电针相关的有149篇,包括普通电针(n=134)、针药联合(n=1)、头针(n=4)和电针艾灸对比(n=10);艾灸相关16篇;其次还有温针灸(n=2)、穴位埋线(n=2)、单纯针刺(n=2)、按法(n=1)、穴位凝胶包埋(n=1)和针刺联合高压氧(n=1)。

2.3.3.2 电针参数 电针治疗仪主要采用韩氏电针治疗仪(HANS-200)、华佗牌SDZ-V或SDZ-Ⅱ电针仪。电针参数的选择方面,主要采用连续波和疏密波,连续波以2 Hz最多(n=43),疏密波以2/100 Hz最多(n=23)。刺激强度有mA和V两种单位,其中刺激强度应用最多的是1 mA(n=77);另有25篇文献没有具体数据,仅提示以肢体轻微颤抖为准,见表2。

表2 近10年针灸防治MIRI动物实验中针灸干预方案的分类统计

2.3.3.3 针灸介入时机和持续时间 在针刺介入时机方面,缺血预处理有124篇,缺血后处理有10篇,再灌注即刻及之后处理有8篇。在针刺持续时间方面,最长60 min,最短15 min,其中20 min最多(n=84)。针刺疗程方面,最长针刺14 d,最短针刺1次,其中7 d的最多(n=78),见表2。

2.3.4 穴位的选择 选穴方面,电针选取的单穴大多为内关穴(n=81),头针全部选取额旁1线(n=4),其余单穴有T4、T5夹脊穴(n=7)、心俞穴(n=3)等。穴位以内关相关的最多(n=31),如内关穴+足三里+关元(n=11)、内关+足三里(n=4)。与内关无关的穴方最多的是神门+通里(n=8)。

艾灸相关文献中,有每次约5～7次的麦粒灸(n=10)和5 mg/壮的艾炷灸(n=2)。艾灸疗程最短为4 d,最长为14 d,最多的疗程为5 d(n=6)。艾灸选穴有内关穴(n=13)、内关+间使+足三里+上巨虚(n=1)、足三里+内关+关元(n=1)和膻中+膈俞(n=1),见表2。

2.3.5 对照组干预措施 在MIRI的相关实验中一篇文献可以有多个研究内容,研究内容不同对照组也不同。阴性对照有假手术组和(或)正常组(n=164)、模型组(n=164)。机制探索的其他对照组有抑制剂或激动剂组(n=24)、电针+抑制剂或激动剂(n=23)、非穴对照组(n=49)和缺血预处理组(n=13)等,见表3。

表3 近10年针灸防治MIRI动物实验中对照组干预措施的分类统计

2.3.6 结局指标 结局指标分为一般情况、形态学指标、功能学指标和分子生物学指标。纳入文献中有78篇选用了形态学指标,其中有测量心肌梗死面积(n=48)、观察心肌细胞组织病理形态改变(n=45)等内容。79篇选用功能学指标,有测量心电图ST段变化和(或)T波改变(n=44)、心肌细胞凋亡指数(n=29),检测心功能(n=21)等内容。139篇文献选用分子生物学指标,包括检测心肌损伤标志物(n=50),如肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T, cTnT)等;炎症反应标志物(n=30),如白细胞介素( interleukin, IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF)-α等;氧化应激标志物(n=35),如活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮、热休克蛋白等;能量代谢指标物(n=19),如线粒体相关如线粒体膜电位/吸光度/完整性、腺苷A1、磁共振氢谱检测代谢物质等;细胞凋亡相关指标(n=23),如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)相关蛋白表达、死亡因子(factor associated suicide, fas)/死亡因子配体(fas ligand, fasL)相关蛋白表达等;自噬基因相关指标(n=17),如B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)相关蛋白表达、自噬相关蛋白Beclin1等,见表4。

表4 近10年针灸防治MIRI动物实验中结局指标的分类统计

3 讨论

随着心血管疾病患病率的上升和介入等技术的发展,心肌缺血再灌注损伤的研究也在进一步发展。在长期实验过程中针刺对MIRI的作用效果被大量证实,目前更多的研究在于探索实验动物的选择、合适的干预方案和作用机制。具体内容现论述如下:

3.1 实验动物的选取

纳入文献的实验动物多为SD大鼠和wistar大鼠,其中10周龄wistar雄性大鼠的体质量可达280～300 g,10周龄SD雄性大鼠的体质量可达300～400 g,研究选用的SD大鼠普遍比Wistar大鼠重,符合上述规律。另外SD大鼠造模缺血时间多为30或40 min,再灌注时间一般不少于60 min,Wistar大鼠缺血时间多为20或30 min,再灌注时间多小于60 min。可以看出Wistar大鼠所用造模时间平均少于SD大鼠。这可能是因为Wistar大鼠的体质量普遍比SD大鼠低且应激反应灵敏,另外SD大鼠是由Wistar大鼠培育而成的,适应性和抗病能力更强。研究发现两种大鼠心房肌细胞中心钠素即心房利钠多肽(polypeptide, ANP)的含量不同,释放方式也有区别,SD大鼠心房特殊颗粒(specific atrial granule, ASG)分为A、B两型,颗粒平均直径大于Wistar大鼠,Wistar大鼠未见B型颗粒,颗粒的体密度和数密度大于SD大鼠[4]。ANP的含量与释放和心房特殊颗粒相关,心肌缺血时ANP释放,对MIRI有抑制作用[5],因此释放ANP多的大鼠可能所需造模时间更长。考虑到时间、资金和成功率的问题,建议使用造模时间相对较少的Wistar大鼠,缺血30 min再灌注40 min,在造模的过程中,改用钓鱼丝线固定时用的硅胶太空豆来进行勒线取代缝合线打活结,与此同时线绳下垫橡胶圈,这样不仅使手术造模的操作更加简便,造模成功率也提高到90%[6]。

3.2 针灸干预方案

在电针参数选择方面,研究发现不同频率作用不同:在镇痛方面2 Hz可刺激内啡肽和脑啡肽的释放,100 Hz则刺激强啡肽的释放,两种频率交替的疏密波可刺激三种物质同时释放[7];神经系统疾病中高频电针可更有效地减少自由基损害,保护细胞,低频电针则对神经和肌细胞的再生和修复有优势;循环系统疾病中高频电针比低频电针在减轻应激保护心肌上更有优势。综上,高频电针常用于止痛、镇静、缓解肌肉和血管痉挛,低频电针常用于治疗痿证、肌肉韧带等损伤[8]。本文的纳入文献中,有3篇文献对电流频率进行比较,提示总体高频较低频有优势[9-11]。目前研究主要使用低频,高频电针相关研究很少,推荐未来研究使用中高频电针。另外疏密波(n=68)和连续波(n=64)使用次数相近,后续可研究疏密波和持续高频谁更有优势。刺激强度方面,有文献进行了电流强度的对照实验[12],比较了0.2 mA、1 mA、2 mA、4 mA、6 mA、8 mA电流强度对结果的影响,结论是2 mA的刺激强度对MIRI的预防更有效。但纳入的研究中77篇使用1 mA的电流强度,仅6篇使用2 mA,建议未来的研究可以关注不同电流强度的疗效差异。

在疗程方面,有研究对比针刺7 d和14 d保护作用的差异[13],结果提示差异无统计学意义;两篇文献研究艾灸5 d和10 d保护作用的差异[14-15],但结果并不统一,无法得出结论。因此,未来可进行不同针刺时程的疗效差异研究,以明确针灸干预的最佳疗程,在疗效最大化的同时节约成本。

在针灸介入时机方面,大多数的研究为缺血预处理,但由于缺血不可预见,缺血后针灸更具有临床适用性,因此,近年来缺血后干预也受到了人们重视,有研究对缺血后针刺的干预时相进行了效果对比,比较再灌注前、再灌注即刻和再灌注前后均针刺的效果差异,结果提示再灌注前后均针刺对MIRI损伤的治疗效果最好[16-17]。另外,有实验比较了再灌注后不同时期电针对心肌细胞自噬相关蛋白表达的影响,显示再灌注0.5 h后电针干预效果最为显著[18]。但针灸预处理和针灸后处理的疗效是否存在差异,尚未有研究报道,未来可进行相关研究,为临床治疗提供理论依据。

综上所述,电针频率、刺激强度,针灸疗程、介入时机方面都有待进一步优化治疗方案,更好地服务临床。

3.3 穴位的选取

针灸选穴方面,目前的研究多采用单穴治疗,尤其以“内关”穴使用频率最高。内关穴是手厥阴心包经络穴,《灵枢·邪客》记载“故诸邪之在于心者,皆在于心之包络”[19],当外邪侵犯心脏时,心包代为受邪,因此心包经穴位是治疗心脏疾病时常见的选择。内关穴为心包经络穴,研究发现《黄帝内经》等古籍的有效处方中,内关穴为针灸治疗心痛使用频次的第五位[20]。《针灸大成》说内关“主手中风热……实则心暴痛,泻之……”[21],后人更是在《四总穴歌》基础上增补了“心胸内关谋”的说法[22]。因此内关一直是历代医家治疗心胸疾病的常用穴位。现代医学发现电针内关穴可减少心肌梗死面积,降低再灌注后心电图ST段电位值和心肌损伤标志物含量,刺激血清腺苷的释放,对心肌有保护作用[23]。且内关穴在抑制氧化应激、减轻炎症反应、减轻钙超载、调节能量代谢和调控相关信号通路方面都有保护作用[24]。且研究表明,内关相较于阳陵泉、曲池等普通穴位效果更好,与夹脊穴的保护作用具有高度的一致性[25-26],因此推荐使用内关穴作为治疗穴位。

然而,在临床实际应用中多使用配穴治疗。合理的腧穴配伍能提高针灸的临床疗效,不同腧穴配伍间的差异也一直是基础针灸学研究的重点。通过对现有文献的梳理,发现针灸在治疗MIRI时配穴方法多样,主穴常选内关穴,配穴常用足三里、关元、心俞、膻中、神门、通里、间使、夹脊等,另外亦有单独选用神门与通里相配伍治疗者,但不同配穴的疗效是否存在差异尚不清楚。有研究发现,本经原络配穴和相表里经原络配穴对急性心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护效应存在差异[27]。因此,未来可从影响针灸疗效的重要因素——穴位配伍方面,进行不同配穴疗效的比较研究,以更好地应用于临床。

3.4 干预措施的选择

心肌缺血再灌注损伤属于“胸痹”病,病机为本虚标实,艾灸温热补益,针刺疏通泄实。有研究发现,在下调自噬相关蛋白表达方面[28],电针优于艾灸;而在增强热休克蛋白表达能力方面艾灸预处理优于电针预处理[29]。因此,后续可进一步研究比较两者作用机制的不同,在临床上选出最优方案。Lee等设计实验探究添加更多的治疗方式是否会有更好的治疗效果,设置电针组、电针+背俞电针组、电针+背俞+艾灸组,发现三组之间没有额外的差异,添加几种治疗方法并不一定会增加保护作用[30]。

3.5 机制研究的进展

目前对MIRI的认识主要包含三个方面:①氧自由基的大量产生;②再灌注导致的细胞内钙离子超载;③白细胞作用和微血管损伤[31]。实际上MIRI是一个复杂的,涉及基因通路、分子、细胞等多层次多因素交互作用的过程,很难明确将其机制严格归类。刘丹勇等[32]将MIRI的机制总结为氧化应激、细胞内钙超载、能量代谢障碍、细胞凋亡、内质网应激、自噬、焦亡、铁死亡、程序性坏死。杨丽华等[33]人认为线粒体功能障碍可引起钙超载、活性氧生成及线粒体膜通透性增加等问题,最终导致细胞凋亡。白桦[34]则解释了MIRI炎症反应的动态变化,将缺血心肌的恢复分为急性促炎期和抗炎恢复期,促炎反应会导致两个阶段之间的平衡和转化的紊乱,加重心肌损伤。另外还有从神经系统释放的单胺类物质入手MIRI与脑相关的研究[35],结果显示电针可通过“大脑边缘-下丘脑-自主神经系统”调节心脏功能。可见,针灸的作用是多靶点的,期待后续能发现新的角度研究MIRI机制,最终使MIRI的预防或治疗有一套统一全面的评价方式。

4 结语

综上所述,本文对近10年来针灸治疗MIRI动物实验研究文献从实验动物选取、造模、干预措施、对照组、结局指标和研究内容等方面进行分析总结,肯定了针灸对MIRI的效果,建议今后注重针灸干预方案、穴位的选择及不同针灸干预措施对MIRI保护效应的影响,并进一步探讨针灸的作用机制,以阐释针灸的作用原理,优选针灸治疗方案,最终指导临床,提高临床疗效。