基于网络药理学与实验验证探讨通脉颗粒治疗缺血性脑卒中的作用机制*

苗 青,王瑞海,李玉波,刘丽梅

(中国中医科学院中医基础理论研究所,北京 100700)

脑卒中是由于脑血管破裂出血和脑血管堵塞影响脑部供血,从而引起脑组织损伤的急性脑血管疾病,是我国成人致死、致残的首位病因[1-2]。缺血性脑卒中(ischemic stroke, IS)为脑卒中的主要亚型,近30年来IS的年龄标准化发病率增加了34.7%,且仍呈现出持续上升的趋势[3]。目前,IS的临床治疗多集中在溶栓和神经保护方面,受时间窗较窄、作用靶点单一等问题的影响,治疗药物仍然有限。方剂具有多成分、多靶点、多途径的作用特点,其与西药联合应用在治疗IS中突显独特优势,目前备受关注。

通脉颗粒最早收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第四册[4],之后转为国家药品标准,由丹参、川芎、葛根3味药以1:1:1的比例配伍组成,具有活血通脉的功效。临床研究发现,通脉颗粒联合尿激酶溶栓治疗后,临床总有效率从69.5%提高到94.59%,神经功能缺损评分由(14.86±5.45)分降低到(11.42±4.97)分[5]。这表明通脉颗粒与溶栓药物合用,可显著增强患者的溶栓治疗效果,有效恢复脑部神经功能,明显改善患者预后。目前,关于通脉颗粒治疗IS作用机制的研究较少,有必要作进一步的系统分析。因此,本研究将通过网络药理学分析挖掘通脉颗粒治疗IS的潜在作用靶点和通路,并对其进行动物实验验证。本研究可为今后指导通脉颗粒临床用药和进一步开发提供科学依据。

1 网络药理学分析

1.1 通脉颗粒潜在活性成分及作用靶点筛选

在TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和TCMIP数据库(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)中检索丹参、川芎、葛根3味中药的化学成分,根据口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug-likeness, DL)≥0.18,并结合《中华人民共和国药典》2020年版[6]及文献[7-18]补充完善各味中药的化学成分,去除重复后,筛选出通脉颗粒的潜在活性成分。同时,通过TCMSP数据库和TCMIP数据库查询潜在活性成分的作用靶点,应用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)以物种为“Homo sapiens”将靶点名字规范化,剔除非人源、不规范的靶点。

1.2 缺血性脑卒中相关靶点筛选

以“ischemic stroke”“cerebral ischemia”“stroke”等为关键词,在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Drugbank数据库(https://go.drugbank.com /drugs)、TTD数据库(https://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)收集缺血性脑卒中的相关靶点。其中,GeneCards数据库中选取Score大于中位数的目标靶点作为IS靶点。采用Uniprot数据库对收集的靶点进行靶点-人类基因名转换,去除重复靶点后,构建IS疾病靶点数据库。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络建构及核心靶点预测

将通脉颗粒的预测作用靶点与IS相关靶点导入VENNY 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)绘制韦恩图,得到药物与疾病的交集靶点。将交集靶点上传至STRING 11.5(https://string-db.org/),设置物种为“Homo sapiens”,靶点间最小相互作用阈值设置为medium confidence(0.400)。将结果导入Cytoscape 3.8构建PPI网络并依据Degree、Betweenness、Closeness进行拓扑分析,以Degree≥2倍中位数并结合Betweenness、Closeness均大于等于中位数为标准筛选核心靶点。

1.4 通脉颗粒治疗IS靶点的富集分析

将上述获得的交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/),设置物种为“Homo sapiens”,进行GO富集分析和KEGG富集分析。富集分析结果依据Pvalue<0.05进行筛选、排序,并使用微生信软件(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化。

2 动物实验

2.1 动物

SD雄性大鼠,体质量(200±10)g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号SCXK(京)2019-0010。实验前大鼠适应性喂养1周,饲养条件为自然昼夜节律光照,温度22～25 ℃,相对湿度40%～50%,自由饮水进食。本实验已通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理委员会审查批准,批件编号:IBTCMCACMS21-2211-01。

2.2 主要试药与仪器

通脉颗粒(神威药业集团有限公司,批号:22021021);阳性对照药脑心通胶囊(陕西步长制药有限公司,批号:211169);白细胞介素(interleukin, IL)-6试剂盒、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor , TNF)-α试剂盒、IL-4试剂盒、IL-10试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司,货号:20230101-RX302856R、20230101-RX302058R、20230101-RX302858R、20230101-RX302880R);Iba-1抗体(英国Abcam公司,货号:ab178847)。3K15型高速冷冻离心机(德国Sigma公司);U-LH100HG型电子显微镜(日本奥林巴斯有限公司);FLx800TM型荧光发光酶标仪(美国Bio Tek公司);KZ-Ⅱ匀浆仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

2.3 造模、分组与给药

大鼠适应性喂养1周后,采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法复制IS模型[19]。依据Longa评分法[20]对各组大鼠进行神经功能评分。0分-正常,无神经损害的症状;1分-不能伸展脑缺血对侧的前肢;2分-向缺血对侧转圈;3分-向缺血对侧倾倒;4分-不能自发行走,意识丧失。选择分值在1～3分的30只大鼠,随机分为5组:模型组、阳性对照组(脑心通胶囊)、通脉颗粒低剂量组(1.35 g/kg)、通脉颗粒中剂量组(2.7 g/kg)和通脉颗粒高剂量组(5.4 g/kg),另取6只正常大鼠作为假手术组。各给药组大鼠给予相应的药物灌胃7 d,假手术组和模型组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃。

2.4 神经功能缺损评分

末次给药后,参照Longa评分法对各组大鼠进行神经功能缺损评分。

2.5 脑组织病理学观察

对各组大鼠进行神经功能评分后,分别取脑,4%多聚甲醛固定。将固定好的脑组织进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色后,进行脑组织皮层病理学观察。

2.6 免疫荧光染色

将4%多聚甲醛固定的大鼠脑组织包埋,制备4 μm冠状切片。脑切片经室温下Triton X-100破膜、山羊血清封闭后,滴加一抗,即Iba-1抗体(1:200),4 ℃孵育过夜;次日加入二抗于37 ℃下避光孵育;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)封片,于荧光显微镜下观察皮层小胶质细胞的表达情况并采集图像。

2.7 炎症因子检测

按照ELISA试剂盒说明书,分别检测各组大鼠脑组织皮层IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10水平。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 通脉颗粒治疗缺血性脑卒中的靶点预测结果

通过检索TCMSP数据库和TCMIP数据库进行OB、DL筛选,并结合《中华人民共和国药典》2020年版及文献报道,补充丹参、川芎、葛根中不符合筛选标准的其他活性较强的成分,如表1所示,最终获得87个通脉颗粒的潜在活性成分(丹参64个,川芎12个,葛根11个),360个作用靶点[21]。将GeneCards数据库、Drugbank数据库、TTD数据库和OMIM数据库检索结果合并,获得IS相关靶点649个。将通脉颗粒的预测作用靶点与IS相关靶点进行映射,如图1所示,得到115个交集靶点。

图1 通脉颗粒治疗缺血性脑卒中的潜在靶点韦恩图

表1 通脉颗粒的潜在活性成分

3.2 PPI网络的构建与分析结果

将通脉颗粒的预测作用靶点与IS相关靶点的115个交集靶点导入STRING 11.5,获得蛋白质间的相互作用关系。去除无连接节点,共得到关键节点115个和575条边。将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络,根据拓扑分析以Degree≥116,并结合Betweenness≥3.92×10-3、Closeness≥0.49,筛选出排列前5的关键靶点,分别为IL-6、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT(serine/threonine-protein kinase AKT, AKT)1、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、β-肌动蛋白(beta-actin, ACTB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A, VEGFA),推测这些靶点可能是通脉颗粒作用于IS的关键靶点。并以此推出相对应的有效化学成分,构建药物-潜在活性成分-作用靶点网络图,见图2。

图2 通脉颗粒治疗缺血性脑卒中的药物-潜在活性成分-作用靶点网络图

3.3 富集分析结果

GO富集分析共得到851个条目,其中包含660个生物过程(biological process, BP)、83个细胞组分(cell component, CC)、108个分子功能(molecular function, MF),分别选取前10条使用微生信软件进行可视化,结果如图3所示,BP主要涉及对外来生物刺激反应(response to xenobiotic stimulus)、对缺氧反应(response to hypoxia)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、血管新生(angiogenesis)、负调控凋亡过程(negative regulation of apoptotic process)等生物过程,CC主要涉及质膜(plasma membrane)、细胞外空间(extracellular space)、细胞表面(cell surface)、内质网腔(endoplasmic reticulum lumen)、突触(synapse)等细胞组分,MF主要涉及酶结合(enzyme binding)、蛋白结合(protein binding)、电压门控钙通道活性(voltage-gated calcium channel activity)、转录因子结合(transcription factor binding)、细胞因子活性(cytokine activity)等分子功能。

图3 GO功能富集分析结果

KEGG富集分析共得到161条通路,选取前20条使用微生信软件进行可视化,结果如图4所示,通脉颗粒作用于缺血性脑卒中的作用机制可能与Calcium信号通路、Fluid shear stress and atherosclerosis、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT(phosphatidylinositide 3-kinases-serine/threonine-protein kinase AKT, PI3K-Akt)信号通路、TNF信号通路等有关。

图4 KEGG富集分析结果

3.4 通脉颗粒对IS大鼠神经功能评分的影响

如图5所示,末次给药后,对各组大鼠进行神经功能评分发现,假手术组大鼠未见神经功能损伤;模型组大鼠均表现出严重的神经功能损伤症状(P<0.05),如左侧肢体无力,行走时身体向左侧偏斜或旋转,甚至不能自发行走,提尾悬空时左前肢屈曲;与模型组比较,各给药组大鼠活动增多,神经功能明显改善,各组大鼠神经功能评分均不同程度降低(P<0.05),特别是通脉颗粒中、高剂量组,表明通脉颗粒可减轻IS大鼠的神经功能损伤。

注:与假手术组比较*P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01图5 通脉颗粒对各组大鼠神经功能评分的影响

3.5 通脉颗粒对IS大鼠脑组织病理变化的影响

如图6所示,假手术组大鼠脑组织皮层细胞形态规则、排列整齐,未见炎性细胞浸润和水肿;模型组大鼠可见明显梗死灶,细胞排列疏松紊乱,细胞核固缩深染,细胞质呈空泡化,伴有小胶质细胞增生和炎性细胞浸润;与模型组比较,各给药组大鼠脑组织梗死灶明显缩小,其中通脉颗粒高剂量组大鼠脑组织细胞排列相对整齐,细胞核较清晰,水肿和炎性细胞浸润明显减少。

A.假手术组;B.模型组;C.阳性对照组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组图6 通脉颗粒对缺血性脑卒中大鼠脑组织病理变化的影响(HE ×100)

3.6 通脉颗粒对IS大鼠脑组织小胶质细胞的影响

如图7所示,假手术组大鼠皮层小胶质细胞呈静息状态,胞体较小、分支较长;模型组大鼠小胶质细胞大多胞体变大,表面突起变短,呈典型的阿米巴状,表明小胶质细胞极化程度变高,多数细胞趋向于转化为M1型小胶质细胞,不同浓度的通脉颗粒处理后,M1型小胶质细胞减少,阿米巴状变化出现一定改善,表明通脉颗粒可抑制小胶质细胞极化。

图7 通脉颗粒对缺血性脑卒中大鼠脑组织Iba1表达的影响(×100)

3.7 通脉颗粒对IS大鼠脑组织皮层中炎症因子的影响

如图8所示,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中IL-6和TNF-α表达显著升高(P<0.01),IL-4和IL-10表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,通脉颗粒中、高剂量组大鼠脑组织中IL-6和TNF-α表达均显著降低(P<0.05),IL-4、IL-10的表达均显著升高(P<0.05)。

注:与假手术组比较*P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01;白细胞介素(IL),肿瘤坏死因子(TNF)图8 通脉颗粒对各组大鼠脑组织炎症因子表达水平的影响

4 讨论

通脉颗粒主要适应证为缺血性心脑血管疾病,主要针对经络之气虚血瘀证而立,已批准上市并应用于临床20余年。方中丹参为活血化瘀药之首,专行脉络闭塞,为君药[22];川芎行气活血,气行则血行,助君药活血化瘀,为臣药[23];葛根升举清阳,通经活络,配伍丹参能增强祛瘀生新之力,配伍川芎则补而不滞[24]。丹参为血药,川芎为血中气药,葛根为气药,三药合用共奏益气活血、化瘀通络之功,并根据各自的功效特点分别对应不同症状或病因,在不同环节相辅相成,活血、行气、升阳,以达到气行血和、活血通脉之效[25]。

本研究中采用MCAO法复制IS大鼠模型,造模后大鼠表现出严重的神经功能损伤;给予通脉颗粒干预后,大鼠神经功能损伤减轻,提示通脉颗粒可明显改善IS大鼠神经功能。为进一步系统分析通脉颗粒治疗IS的作用机制,本研究采用网络药理学分析初步筛选出通脉颗粒作用于IS的关键靶点IL-6、AKT1、TNF、ACTB、VEGFA,发现可能的作用机制与MAPK、PI3K-Akt、TNF、IL-17等信号通路有关。临床研究发现,IS患者预后不良与炎症标志物水平升高密切相关[26],故网络药理学结果提示通脉颗粒治疗IS的作用机制可能与其抑制炎症反应密切相关。

炎症反应是脑缺血后继发性脑损伤的关键因素,减轻炎症损伤是改善IS预后的关键。脑缺血发生后,脑内的免疫细胞被迅速激活,刺激中枢神经系统并释放趋化因子,招募外周的中性粒细胞、淋巴细胞向受损的脑组织迁移,合成分泌一系列炎性细胞因子,加剧炎症反应,进一步引起神经元受损,加重神经功能损伤[27-28]。小胶质细胞是中枢神经系统固有的免疫细胞,参与IS的病理生理过程,是抵御脑损伤的第一道防线[29]。脑缺血发生后,小胶质细胞被迅速活化,分为促炎型M1和抗炎型M2两种表型。M1型小胶质细胞具有吞噬、杀灭病原体的功能,但同时产生大量TNF-α、IL-6等促炎因子引起炎症反应,加重神经功能损伤;M2型小胶质细胞主要产生IL-4、IL-10等,抑制炎症反应并促进组织修复[30-32]。由此可见,小胶质细胞对IS具有双重调节作用,以不同的表型调节中枢神经系统的稳态。本研究发现,假手术组小胶质细胞呈胞体小、分支长的状态,模型组小胶质细胞胞体变大、分支变短,呈阿米巴样,表明小胶质细胞被激活,并趋向于M1型极化;通脉颗粒干预后,小胶质细胞形态发生改变,阿米巴状变化有一定改善。同时,本研究对炎症因子IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10的表达水平进行检测,结果发现通脉颗粒可显著降低大鼠脑组织中IL-6、TNF-α的表达水平,显著升高IL-4和IL-10的表达水平,进一步验证了通脉颗粒可改变小胶质细胞的活化状态,减轻脑组织炎症反应,有助于改善神经功能损伤;同时,动物实验的结果与网络药理学预测的通脉颗粒治疗IS的关键靶点包括IL-6、TNF-α相一致。

综上所述,采用网络药理学对通脉颗粒治疗IS的作用机制进行了系统研究,并通过动物实验验证了通脉颗粒可抑制炎症因子的表达,改善神经功能损伤,其作用机制可能与调控小胶质细胞介导的炎症反应相关。研究结果为今后指导通脉颗粒临床用药和进一步开发提供了科学依据与实验支撑。但本研究仍存在一定的局限性,后续将对通脉颗粒干预后小胶质细胞的表型进行深入分析,为本研究的预测结果提供更加严谨的实验数据。