铁皮石斛多糖的低共熔溶剂提取工艺优化

冯思敏，廖伟先，潘杰峰，余佳浩，陈碧莲，邵 平,

（1.浙江工业大学食品科学与工程学院，浙江杭州 310014；2.浙江工业大学化学工程学院，浙江杭州 310014；3.浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052）

铁皮石斛是兰科属草本植物，被称为“九大仙草之首”，含有多种活性物质，如多糖、氨基酸类和生物碱等[1]。其中，铁皮石斛多糖是铁皮石斛的主要功能活性成分，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤和降血糖等作用[2-5]。因此，建立高效、绿色的铁皮石斛多糖提取工艺有利于铁皮石斛的药食两用价值的开发。邱现创等[6]通过超声辅助法提取铁皮石斛多糖，提取率可达25.39%。廖霞等[7]利用微波辅助结合酶解提取法，铁皮石斛多糖提取率可达29.40%。李贝贝等[8]研究了闪式提取法提取铁皮石斛多糖，在最佳优化工艺条件下浸泡30 min 后，常温下提取3 次，提取率达到31.45%。Kui 等[9]从石斛中提取出了3 种水溶性多糖，其主要由甘露糖和葡萄糖以不同的比例组成。高云霄等[10]用热水浸提法从铁皮石斛中提取得到一种以1,4-链接为主，存在少量1,2,4-、1,3,4-、1,4,6-分支结构和端基结构的O-乙酰化葡甘露聚糖。铁皮石斛多糖的结构是其呈现生物活性的基础，选择不同的提取、纯化分离方法，所得到的多糖在单糖组成及多糖结构上会有显著不同，而这往往会直接影响多糖的生物活性。

低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）由氢键受体和氢键供体混合而成[11]。DES 已被证明是一种新型绿色溶剂，具有成本低、易合成、无毒和可生物降解等优异性能[12-14]。其现已被用于功能成分的提取，如提取槲皮素[15-16]、提取甜菜碱[17-18]及提取姜黄素[19-20]，目前，已有部分研究将DES 的绿色提取工艺用于铁皮石斛总黄酮的提取[21]，但其在铁皮石斛多糖的提取中应用较少。

DES 具有安全性高、价格低廉及绿色等特点，课题组前期对近40 种不同比例和原料的DES 进行了筛选，发现基于氯化胆碱及乳酸的DES 产生的氢键数最多[22]。因此，本研究选择氯化胆碱与乳酸作为制作DES 的原料，利用响应面法优化铁皮石斛多糖的提取工艺。在铁皮石斛多糖提取后，进一步研究其单糖组成及可能的分子结构，以期为铁皮石斛多糖的高效提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛 购自云山斛皮石斛基地；苯酚、浓硫酸、乳酸、鼠李糖（纯度98%）、半乳糖（98%）、核糖（纯度>99.5%）、木糖（纯度99%）国药集团化学试剂有限公司；氯化胆碱、阿拉伯糖（纯度98%）杭州吉工生物科技有限公司；无水硫酸钠 杭州双木化工有限公司；DEAE-52 纤维素柱填料、Sephadex G-100上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖（纯度99.7%）、乙酸酐 杭州邦易化工有限公司；无水乙醇、甘露糖（纯度99%）杭州方平化工有限公司；D2O 安徽泽生科技有限公司；三氟乙酸 德国Merck 公司；盐酸羟胺、吡啶 上海泰坦科技股份有限公司；所用试剂均为分析纯；实验室用水均为超纯水。

HWS-12 型数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；P7 型紫外分光光度计 北京高能科迪科技有限公司；RE-52 型旋蒸仪 上海锦赋实验仪器设备有限公司；DDSJ-308A 型电导率测定仪 雷滋仪电科学仪器股份有限公司；Bruker AM-600 型核磁共振 Bruker Physik-AG 公司；Finnigan Trace Ultra-DSQ II 单四级杆气相色谱-质谱联用仪器Thermo 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DES 试剂的制备 参考DES 的制作方法[23-25]并稍作修改，将氯化胆碱与乳酸以摩尔比4:1 称量20 g 氯化胆碱，50 g 乳酸，置于蓝盖瓶中，后加入21 mL的去离子水混合，置于80 ℃的数显恒温水浴锅内加热至大部分试剂熔化，再转移至磁力加热搅拌器上，在80 ℃下不断搅拌获得均一透明的液体，即为DES，然后按照添加水稀释到不同浓度的DES，贮藏备用。

1.2.2 铁皮石斛粗多糖的提取 称取约1.00 g 铁皮石斛粉末，按照一定的液料比加入不同浓度的DES，设定提取温度及提取时间，提取完成后离心（4000 r/min、20 min），取上清液，加入其4 倍体积的无水乙醇进行沉淀，并常温静置过夜，第二天进行离心去上清液后复溶铁皮石斛粗多糖，利用旋蒸去除乙醇，得到铁皮石斛粗多糖。

1.2.3 单因素实验 以铁皮石斛多糖提取率为指标，参照李佳等[2]选取2 h 为本试验的提取时间，温度设置为70 ℃，液料比为90:1 mL/g，考察DES 浓度（20%、30%、40%、50%、60%）；DES 浓度为30%，液料比为90:1 mL/g，考察提取温度（50、60、70、80、90 ℃）；温度设置为70 ℃，DES 浓度为30%，考察液料比（50:1、70:1、90:1、110:1、130:1 mL/g）对铁皮石斛多糖提取率的影响。

1.2.4 响应面试验 依据单因素实验结果，运用Design-Expert 8.0.6 软件进行 Box-Behnken 试验，采用三因素三水平（A：DES 浓度、B：提取温度、C：液料比）进行响应面试验设计，考察铁皮石斛多糖提取率变化，因素水平设计见表1。

表1 响应面设计因素与水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.5 阴离子交换柱纯化多糖 将所得粗铁皮石斛多糖粉末溶解，用微孔滤膜去除杂质后，经压力泵上样注入DEAE-52 阴离子交换柱，采用 0、0.05、0.1、0.3、0.5 mol/L 的氯化钠溶液进行梯度洗脱[13]。利用自动收集器收集洗脱液，每管收集体积为10 mL。采用苯酚-硫酸法测定每管洗脱液的多糖含量，并测定其在490 nm 下的紫外分光光度，以管数为横坐标，多糖吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。合并相同组分洗脱液浓缩冻干，得到纯多糖。

1.2.6 葡聚糖凝胶柱纯化多糖 对经阴离子交换柱纯化后所得的铁皮石斛多糖洗脱组分进行葡聚糖凝胶柱纯化[14]，称取铁皮石斛多糖溶于蒸馏水中，配制成浓度为10 mg/mL 的溶液，定容后用微孔滤膜过滤，经Sephadex G-100 凝胶色谱柱进行纯化，用蒸馏水作为洗脱液，用自动收集器收集，每管收集体积8 mL。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以管数为横坐标，多糖吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。收集所得到的多糖溶液进行冻干得到铁皮石斛精多糖。

1.2.7 多糖提取率及纯度测定方法 葡萄糖标准曲线制备：采用苯酚-硫酸法[26]制作标准曲线，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为y=0.9229x-0.0144，R2=0.9989。按照1.2.2 的方法提取操作重复3 次，用苯酚-硫酸法比对标准曲线测定总糖含量。参照贾夏等[27]的3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖的浓度，并计算多糖的纯度。

式中：M总，总糖的质量，g；M还，还原糖的质量，g；M，粗多糖质量，g。

按下列公式计算多糖提取率：

式中：M多糖，粗多糖中多糖的质量，g；m，称取的铁皮石斛粉的质量，g。

1.2.8 铁皮石斛多糖的单糖组成测定 参照Anna等[28]并稍作修改，精确称取10.0 mg 铁皮石斛多糖至具塞试管，加入6 mL 2 mol/L 三氟乙酸，密封置于110 ℃烘箱中水解2 h，冷却后加入2 mL 甲醇旋转蒸发，再依次加入盐酸羟胺10 mg、吡啶2.5 mL，90 ℃水浴加热30 min，冷却后加入乙酸酐2.5 mL，90 ℃水浴加热30 min，冷却，即得多糖衍生化物。其余各单糖标准品的制备方法同上。最后进行GCMS 测定[19]。

1.2.9 铁皮石斛多糖的核磁共振测试 参照Xi 等[29]并作修改，精确称取100.0 mg 干燥的铁皮石斛多糖用D2O 溶解后，冷冻干燥，如此反复3 次，将溶解后的多糖置于核磁管中在Bruker AM-600 型核磁共振仪上进行均一多糖的核磁谱图测定，扫描时间为8 h，对其进行1H-NMR 和13C-NMR 分析，得到核磁共振图谱。

1.3 数据处理

采用软件Design-Expert.V8.0.6.1 进行响应面分析，数据通过Graphpad Prism 8 软件进行计算绘图。采用多重比较法进行显著性分析（P<0.05 表示差异显著）。实验数据为三组数据平均值，以平均值±标准偏差（X±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 DES 浓度对铁皮石斛多糖提取率的影响 DES浓度的变化对铁皮石斛多糖提取率的影响如图1 所示。由图1 可知，铁皮石斛多糖的提取率呈先上升后逐渐下降的趋势，当DES 的浓度从20%升到40%时多糖提取率从15.1%升到30.7%，原因可能是随着DES 浓度的提高，DES 中氢键受体和配体的数量逐渐增加，导致氢键数目会增加[22]，让更多的多糖渗入到提取液中，从而提高了多糖提取率。当DES 浓度继续提高，多糖的提取率逐渐下降，这是因为DES 试剂是由氯化胆碱和乳酸配制而成，试剂内部离子力通常较强且黏度较大，不利于溶质的溶出，因此在使用过程中加入适量的蒸馏水来降低溶液的剪切力[30]。因此在40%DES 浓度时更有利于铁皮石斛多糖的提取，并选取DES 浓度为30%、40%、50%做响应面试验以确定最佳DES 浓度。

图1 DES 浓度对铁皮石斛多糖提取率的影响Fig.1 Effect of DES concentration on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.1.2 温度对铁皮石斛多糖提取率的影响 温度变化对铁皮石斛多糖提取率的影响如图2 所示。由图2 可知，铁皮石斛多糖的提取率变化呈缓慢上升后下降的趋势，当温度从50 ℃升高到80 ℃时，多糖提取率最高，从14.2%升高到23.4%，是因为随着温度的升高，增加了物质的热运动，提高了多糖分子扩散效率，使多糖在整个体系中的溶解更迅速。当温度继续提升到90 ℃，多糖的提取率反而略有下降。一方面，可能是因温度继续升高时，铁皮石斛多糖中可能存在热敏性物质，在温度升高条件下会使得这些成分易变性降解[31]，另一方面，较高温度导致蒸发，影响了溶剂平衡，从而降低了提取率。因此，选取提取温度为70、80、90 ℃做响应面试验以确定最佳提取温度。

图2 温度对铁皮石斛多糖提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.1.3 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响如图3 所示，铁皮石斛多糖的提取率变化呈现先上升后下降的趋势，当液料比为110:1 时提取率最高，从18.1%升高到32.2%，可能是由于DES 为黏稠液体，在一定范围内，随着液料比提高，溶剂与铁皮石斛的接触面积增多，增加了多糖的溶出，使得多糖提取率增加；但溶剂加入过多时，溶剂用量较大，铁皮石斛粉与溶剂接触面积不断增大，溶出了其他杂质，导致多糖溶解被抑制[32]。因此，选取90:1、110:1、130:1（mL/g）做响应面试验以确定最佳液料比。采用DES 不仅对铁皮石斛多糖实现了绿色提取，同时在提取率上也优于超声辅助、微波辅助结合酶解及闪式提取[6-8]。

图3 液料比对铁皮石斛多糖提取率的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果 在铁皮石斛多糖提取的过程中，以DES 浓度、提取温度和液料比为影响因素，多糖提取率为响应值。试验设计与结果见表2。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Designs and results of Box-Behnken test

2.2.2 响应面二次回归模型的建立与方差分析 由表2 的试验结果，用响应面分析软件操作，得出铁皮石斛多糖提取率为响应值 Y 的回归方程：Y=33.55+1.56A+0.36B+0.75C-0.42AB+0.14AC+0.13BC-6.29A2-6.75B2-5.92C2。

由表3 方差分析结果可知，该模型的F=681.25，回归模型项P<0.0001，失拟项P>0.05，为不显著，说明试验误差小[33]。试验结果与模型拟合度好[34]。由F检验可知，影响铁皮石斛多糖提取率的主次因素为DES 浓度>液料比>提取温度，方差分析显示，A、C 对 Y 影响极显著（P<0.001），B 对 Y 影响显著（P<0.05），A2、B2、C2都是极显著的模型项（P<0.001）。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Regression model of variance analysis results

2.2.3 响应面曲面分析因素之间的交互作用 用Design-Expert 8.6 软件，对DES 浓度、提取温度、液料比3 个因素两两交互，做不同因素间响应面3D图，响应面图和等高线图可以反映各因素间的相互作用及最佳参数。三维图越陡峭[35]，表明相应因素对多糖提取率影响较大。图4B 等高线图为近圆形可知液料比和DES 浓度的交互作用对响应值的影响不显著；由图4C 可知，铁皮石斛多糖的提取率随液料比及提取温度的增加呈先上升后下降的趋势，等高线图为近圆形说明对铁皮石斛多糖提取率无显著影响。由图4 知，两因素交互项AB>AC>BC，其中仅有AB 的P<0.05，表明AB 两因素间交互作用对响应值的影响显著，随着提取温度的升高，分子运动加快，提高了溶剂的渗透能力，提取率随之升高，但温度过高可能会对多糖分子结构产生破坏作用[36]。

图4 各因素交互作用对铁皮石斛多糖提取率的影响Fig.4 Effect of interaction of various factors on the extraction rate of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2.4 响应面优化与验证实验 利由响应面软件分析显示预测最佳提取工艺条件为DES 浓度39.5%、提取温度80.1 ℃、液料比112.4:1（mL/g），铁皮石斛多糖提取率为33.5%。根据实际情况调整提取参数为DES 浓度40%、提取温度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），在此条件下提取2 h，得出验证结果多糖提取率为 33.2%±0.28%，拟合度好，误差为1.7%，充分验证了模型的准确性，该工艺优化合理、有效。多糖的纯度为56.95%±1.2%。与传统的提取方法相比较，本文采用DES 溶剂提取铁皮石斛多糖实现了较高的提取率，陈盛余等[37]采用微波辅助提取铁皮石斛多糖，其提取率为9.77%，而王琳等[38]采用热水浸提法提取铁皮石斛多糖，其提取率为30.83%，均较DES 溶剂提取率低，此外本研究提取方法绿色、安全性高，可以为后续的提取提供一种高效绿色的方案。

2.3 阴离子交换柱纯化

如图5 所示，DOP 纯化后得到3 个多糖洗脱组分，DOP1 为蒸馏水洗脱得到的组分；DOP-2 为0.05 mol/L NaCl 溶液洗脱下的组分；DOP-3 为0.1 mol/L NaCl 溶液洗脱下的组分。由洗脱图谱可见三个组分均未出现拖尾现象，表明各组分间分离效果较好，与DOP-2 和DOP-3 相比较，DOP-1 组分相对含量高，占比为72.6%。洗脱过程在260 和280 nm波长处未出现特征性吸收峰，这表明其不包含游离的蛋白质和核苷酸[39]，达到初步纯化的效果。

图5 铁皮石斛粗多糖阴离子交换柱洗脱曲线Fig.5 Anion exchange column elution curve of crude Dendrobium officinale polysaccharides

2.4 葡聚糖凝胶柱纯化

继续采用Sephadex G-100 色谱柱对DOP-1 进一步纯化，结果如图6 所示。DOP-1 获得一个集中的单峰，表明其纯度较高。收集8～30 管DOP-1 的洗脱液并进行冷冻干燥得到纯化多糖，测定其纯度为90.8%，命名其为DOP-1-1。

图6 铁皮石斛多糖的葡聚糖凝胶柱洗脱曲线Fig.6 Dextran gel column elution profile of Dendrobium officinale polysaccharides

2.5 铁皮石斛的单糖组成分析

采用GC-MS 对DOP-1-1 进行单糖组成分析，多糖的总离子流色谱图如图7 所示。通过对比标准单糖（图7A）可知，铁皮石斛多糖组分主要由葡萄糖和甘露糖单糖组成，根据峰面积计算葡萄糖和甘露糖的总和占比80%，葡萄糖和甘露糖质量比约为43:37，此外还含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等。表明DOP-1-1 是一种葡甘露聚糖为主的杂多糖。

图7 单糖标准品（A）和铁皮石斛多糖（B）GC-MS 总离子流色谱图Fig.7 GC-MS total ion flow chromatogram of monosaccharide standard (A) and Dendrobium officinale polysaccharides (B)

2.6 铁皮石斛多糖的核磁共振分析

铁皮石斛多糖的1H NMR（图8A）显示9 个异头氢，其化学位移δ分别为1.85、2.13、3.29、3.50、3.76、4.07、4.70、5.35、5.45；13C NMR 谱图（图8B）显示有7 个信号峰，其化学位移δ分别为20.28、60.42、69.99、71.54、75.00、76.53、100.16。在4.070～4.741 ppm与4.036～4.703 ppm 处的强烈异头质子信号峰是由D2O 中 的HDO 所引起 的[40]。1H NMR 光谱中δ3.76 ppm 和13C NMR 光谱中δ71.54 ppm 处的强烈信号提示其可能含有（1→3）糖苷键的连接方式[41]。1H NMR 光谱中δ3.29 ppm 和13C NMR 光谱中δ69.99 ppm 处的强烈信号提示多糖中存在（1→4）糖苷键[27]。在δ3.50 ppm 处的信号峰提示提示可能存在（1→2，4）糖苷键[42]。1H NMR 光谱中δ5.45 ppm的化学位移来自1，3-Galp 的H1。此外1H NMR 一般用于研究多糖糖苷键的结构特点[43]，α糖苷键的质子信号通常集中在大于5 ppm 的位置，而β糖苷键的化学位移一般低于5 ppm，表明其同时含有α糖苷键和β糖苷键。

图8 铁皮石斛多糖的核磁共振图谱Fig.8 Nuclear magnetic resonance mapping of Dendrobium officinale polysaccharides

3 结论

本文通过DES 溶剂提取铁皮石斛多糖的结果表明，响应面试验得到最佳提取工艺为DES 浓度40%、提取温度 80 ℃、液料比110:1（mL/g），此条件下铁皮石斛多糖提取率达 33.2%±0.28%，多糖的纯度为56.95%±1.2%。在纤维素柱与凝胶柱纯化后，多糖的纯度可达90.8%，多糖组分主要由葡萄糖和甘露糖构成，其质量比约为43:37，还含有少量的木糖、鼠李糖、核糖等，结构中同时含有α糖苷键和β糖苷键，采用DES 法提取多糖，可以有效提高多糖提取率。本研究建立了一套绿色、高效的铁皮石斛多糖提取方法，为后续的铁皮石斛多糖开发提供参考。