腾冲红花油茶花芽分化及雌配子体发育的形态学观察

韦开萍 杨茜 和润喜 段成波 石卓功 蒙进芳

摘 要：【目的】观察腾冲红花油茶花芽分化与雌配子体发育进程，旨在掌握腾冲红花油茶花芽分化整体进程，明确各分化时期的内部结构特征，完善腾冲红花油茶的生殖生物学基础数据，为腾冲红花油茶的栽培管理提供参考依据。【方法】以腾冲红花油茶为研究材料，采用石蜡切片的方法对其花芽分化及雌配子体的发育过程进行解剖观察。【结果】1）腾冲红花油茶的花芽分化经历了分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花药形成期、雌雄蕊成熟期等6 个时期，历时长达8 个月，分化期间历经较长时间的低温环境。2）腾冲红花油茶子房有3 ～ 4 个心室，每个心室多枚胚珠，每枚胚珠发育状况不一致，胚珠为倒生型胚珠，具双层珠被，胚珠发育属于薄珠心型。9 月初，珠心中央的薄壁细胞迅速分裂形成孢原细胞，孢原细胞继续发育形成大孢子母细胞，在大孢子母细胞发育过程中珠心组织开始被溶解吸收。3）腾冲红花油茶雌配子体发育由大孢子母细胞进行两次减数分裂形成4 个功能大孢子，进而发育成为四核胚囊，四核胚囊通过一次有丝分裂发育形成七细胞八核胚囊。胚囊发育类型为五福花型，胚囊为四孢子胚囊。其胚囊发育类型与普通油茶、攸县油茶的葱型胚囊有明显差异。【结论】腾冲红花油茶花芽分化历经6 个时期；子房有3 ～ 4 个心室；倒生胚珠，薄珠心型；胚囊发育类型为五福花型，胚囊为四孢子胚囊。

关键词：腾冲红花油茶；花芽分化；雌配子体；胚囊发育

中图分类号：S602；S794.4 文献标志码：A 文章编号：1003—8981（2023）03—0244—08

油茶Camellia oleifera 是山茶科山茶属植物，我国重要的木本油料树种，在我国栽培历史悠久，广泛种植[1-2]。而腾冲红花油茶Camellia reticulateLindl f. simplex Sealy是云南特有的木本油料树种，受到生产部门的高度重视[3]。腾冲红花油茶花大而艳丽，具有极高的观赏价值。其种子所榨的油中不饱和脂肪酸含量高达90% 以上，更富含生育酚、鱼鲨烯等生理活性物质，在医学上具有特定作用，是极其健康的食用油[4-5]。由此，腾冲红花油茶也被誉为“中国油茶王”[6]。作为云南山茶花的原生种，野生腾冲红花油茶已成为云南山茶花种质资源的天然宝库，我国茶花专家冯国楣认为：腾冲红花油茶不仅是云南重要的野生生物種质资源，也是中国乃至世界上稀有的珍贵野生木本油料植物和重要的山茶花种质资源宝库[7-9]。腾冲红花油茶由于长期的自由授粉、天然杂交、自然变异形成了丰富多样的自然类型，有丰富的遗传多样性。在最直观的表型上，根据花瓣轮数可将腾冲红花油茶分为单瓣、半重瓣和重瓣3 个类型， 根据其经济性状，可将其分为优质高产的油用类型，花、果兼用类型，价值极高的茶花观赏类型，是具有广阔前景的物种[10-11]。这也为腾冲红花油茶在生产上从自然群体筛选优良性状提供了充足的资源库。但目前由于对该物种的认识不足，需要从各个角度来进行研究，以充分认识该物种的各种生物学特性。

喇燕菲等[12]对金花茶Camellia petelotii （Merrill）Sealy、四季金花茶Camellia perpetua S.Y.Liang etL.D.Huang、淡黄金花茶Camellia flavida Chang 3 个不同种的金花茶的花芽分化进行了研究，结果表明3 种不同金花茶花芽分化过程相似，但分化速度不同，存在明显的重叠分化现象。符喆等[13] 对耐冬山茶Camellia japonica L. 进行花芽分化研究发现早花、晚花品种的耐冬山茶花芽分化物候相差10 ～ 20 天。通过对比分析以往油茶花芽分化的研究结果发现，不同油茶种类花芽分化进程有所不同，普通油茶Camellia oleifera Abel 花芽分化期为5—9 月中下旬，不同无性系之间存在差异；广宁红花油茶（Camellia semiserrata Chi.）花芽分化期为4—9 月下旬；高州油茶Camellia gauchowensisChang 花芽分化时期为5 月中旬—10 月中旬[14]。由此可见，山茶属植物不同种以及不同品种的植物花芽分化进程存在较大差异。在普通油茶花芽分化后期内源激素变化的研究中发现，从雌雄蕊形成期到雌雄蕊成熟期，GA、MEJA、ME-IAA 等9 种激素含量呈先增加后减少的趋势，不同的激素含量对油茶花芽分化会有抑制或促进作用；同时，在对油茶花芽分化的更深研究中也表明，大量元素氮、磷、钾与花芽分化相关的内源激素含量显著相关，比如在前分化期与花芽形态分化期，施肥处理会影响脱落酸、玉米素等激素的含量，而这些效应与花芽分化相应时期对激素比例的需求是一致的，由此则可以通过花芽分化时期制定相应的施肥方案，提高树体花芽质量[15-17]。所以说，研究花芽分化的形态学特征，了解花芽分化时期，可以为植物花芽分化的更深入研究提供理论基础。油茶植物的授粉受精和坐果受雌性细胞发育的影响，而腾冲红花油茶落花落果严重，有些实生林分中还会出现只开花不结果的植株[18-19]。此外，对普通油茶的研究中发现，油茶异常落花落果与雌配子体的发育息息相关[20]。因此，探究腾冲红花花芽分化的形态转变过程，可以了解腾冲红花油茶花芽分化进程，探索腾冲红花油茶与其他油茶种类花芽分化的差异，为开展不同花芽分化时期腾冲红花油茶的相关研究提供理论资料，并可为腾冲红花油茶育种研究与栽培管理措施提供理论依据。

目前，腾冲红花油茶生殖生物学方面的研究还处于空白，所以本研究以腾冲红花油茶为试验材料，采用石蜡切片观察的方法，对腾冲红花油茶的花芽形态分化和雌配子体发育过程进行观察，掌握腾冲红花油茶花芽分化时间及整体进程，明确各分化时期的内部结构特征，完善腾冲红花油茶的生殖生物学基础数据，为腾冲红花油茶花期调控和栽培管理提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019 年7 月－ 2021 年7 月在西南林业大学西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室进行。

在腾冲市林业技术推廣站内栽种的腾冲红花油茶林中选取9 株生长良好、无病虫害发生单瓣类型的健康植株，编号为植株1 ～ 9 号，并挂牌标记。从2019 年7 月开始定期采样，每10 d 采1 次，直到2020 年7 月12 日为止。每次采样3 ～ 5个固定于FPA 固定液（70% 酒精∶丙酸∶甲醛=90%∶5%∶5%）中带回实验室备用。

1.2 石蜡切片制作与观察

石蜡切片具体方法如下：1）取出样品，用镊子、挑针、解剖刀等工具小心地剥去鳞片、花瓣等多余组织；2）剖好的样品用Johannsen Gem 脱水液逐级进行3 h 梯度脱水；3）将装有样品和最后一级Johannsen Gem 脱水液的小瓶子放入真空泵进行6 h 抽真空；4）抽完真空的样品用100% 的叔丁醇进行清洗渗透；5）渗透好的样品置于提前融好的石蜡中进行48 h 浸蜡处理；6）将置有样品的石蜡溶液倒入包埋盒中，置于常温环境下，蜡液冷却凝固后将包埋盒放入冰箱进行温度为4 ℃，时长为6 h 的包埋处理；7）冰箱里取出包埋的蜡块，将蜡块修成梯形；8）将蜡块按需要的切面切割成正六面体，置于切片机上进行切片，切片厚度为8 ～ 10 μm；9）在载玻片上均匀涂上粘片剂，滴加少许蒸馏水在载玻片上，将切好的蜡带用挑针轻轻放在液面上，将有蜡带的载玻片放在35 ℃的展片机上展片；10）待载玻片完全干燥后，使用苏木精染色法进行染色，染色完成后滴少许中性树脂于材料上，盖上盖玻片，切片放在35 ℃烘箱中，烘干后放入切片盒中保存。将切片盒中的片子放在荧光显微镜上观察，初步筛选出结构完整、染色适度、效果较好的切片，用记号笔做上记号。然后用Axio Vision 系统以及生物显微镜进行观察及拍照。

2 结果与分析

2.1 腾冲红花油茶花芽分化的形态特征

根据腾冲红花油茶花芽分化的特点，可将其花芽分化时期划分为分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花药形成期、雌雄蕊成熟期6 个时期。

2.1.1 分化始期

5 月上旬，腾冲红花油茶进入花芽的形态分化期。花芽开始分化，生长点组织形态开始发生变化，生长点分裂速度加快，茎尖生长锥由尖逐渐变圆，生长点横径也逐渐增大（图1A）。

2.1.2 萼片形成期

5 月中旬，茎尖生长锥呈半圆形，花芽此时进入花萼原基分化期。在花萼原基分化期，花萼原基生长快速，细胞分裂让萼片原基逐渐伸长，当花萼原基成长为萼片，顶部弯曲，覆盖住生长点（图1B）。

2.1.3 花瓣形成期

5 月下旬，生长点由圆开始变得平坦，花瓣原基细胞迅速分裂、花瓣生长快速，继而形成花瓣。花瓣形成后，生长点略微向下凹陷并继续增宽（图1C）。

2.1.4 雌雄蕊形成期

6 月上旬，生长点宽度继续增加，生长点上会出现较小较密的雌、雄蕊原基，其中生长点中间相对较大的突起为雌蕊原基，分布在周围较小、数量较多的为雄蕊原基（图1D）。此后，雌蕊原基和雄蕊原基继续生长伸长。随着雌蕊原基的生长，雌蕊原基底部开始膨大，顶端继续伸长（图1E）。

2.1.5 子房花药形成期

6 月中旬—8 月下旬，花芽都处于子房花药形成期。6 月中旬，雌蕊中部生长点会出现心皮原基，心皮原基经过生长发育，逐渐连接，形成由心皮组成的子房室（图1F）。在继续发育中，雌蕊基部心室逐渐增大，至7 月中旬，胎座中部胚珠原基突起，而后胚珠原基继续发育形成胚珠，而雌蕊上部形成花柱和柱头。在雌蕊发育的同时，雄蕊也在持续发育。当雌蕊子房开始发育时，雄蕊也开始分化出花丝、幼嫩花药等结构（图1G）。

2.1.6 雌雄蕊成熟期

9 月上旬，腾冲红花油茶花芽分化开始进入雌、雄蕊成熟期。在这一时期，花柱持续伸长，子房继续增大。腾冲红花油茶子房中绝大部分有3 个心室，有些有4 个心室，子房室里着生多枚胚珠，每个胚珠发育状况不一样（图1H）。在这个时期，胚珠中心会分化出孢原细胞，从而形成成熟胚囊；同时，雄蕊花药也在持续发育（图1I）。腾冲红花油茶雌、雄蕊成熟期持续时间较长，于当年12月—次年1 月左右，雌蕊和雄蕊才会发育成熟，花芽分化结束，形成一个具有萼片、花瓣、雌蕊、雄蕊等器官的完全花。

2.2 腾冲红花油茶雌配子体发育过程的观察

2.2.1 胚珠发育与大孢子发生

7 月中旬，胎座上开始有突起发生，形成胚珠原基（图2A）。胚珠原基进行细胞分裂，进行伸长生长，最终前端发育为胚珠，末端发育为珠柄（图2B）。在胚珠的发育过程中，胚珠原基前端首先发育为珠心，而后原基前端侧面细胞分裂形成环状突起，继而生长发育，逐渐包围珠心，形成内外珠被（图2C）。在珠被形成过程中，内珠被的形成早于外珠被。最后由外珠被、内珠被、珠心、珠柄组成胚珠（图2D）。而通过对胚珠的切片观察以及在珠被的形成过程中，可看到胚珠珠孔端位于珠柄的一侧，而合点端位于珠柄相对的一侧，所以可看出腾冲红花油茶的胚珠为倒生胚珠。9 月初，珠心的薄壁细胞进行分裂而形成多边形的孢原细胞，且可以清晰看到珠心仅有一层组织，由此可判断腾冲红花油茶珠心发育类型为薄珠心型（图2E）。孢原细胞经过发育形成核大、质浓的大孢子母细胞，也叫胚囊母细胞（图2F）。在孢原细胞发育为大孢子母细胞的过程中，发现珠心细胞开始逐渐被溶解吸收。

2.2.2 雌配子体发育

从9 月中旬开始，大孢子母细胞进行第一次减数分裂（图3A），形成2 个功能大孢子（图3B）。之后，两个功能大孢子继续进行第二次减数分裂，形成4 个功能大孢子（图3C）。减数分裂期间的功能大孢子并不形成细胞壁，4 个细胞核处于一个细胞质中。而后4 个大孢子继续生长发育，4 个核分别分散在胚囊中的不同位置，继续发育形成4 核胚囊，最后4 个大孢子2+2 排列分布于胚囊的合点端与珠孔端（图3D）。到12 月—次年1月时，胚囊中的4 个大孢子分别发生一次有丝分裂 ，从而发育形成7 细胞8 核胚囊（图3E—H）。其中，在雌配子体发育中的第一次减数分裂后，发现珠心组织全部消失。

腾冲红花油茶胚囊中的7 个细胞分布不在一个平面内。其中，3 个反足细胞保持核的状态，位于合点端，一般在受精前后退化（图3F）。1 个卵细胞和2 个助细胞组成的卵器呈品字形排列在珠孔端，其中卵细胞朝向于合点端的位置，而2个助细胞分別位于卵细胞的两边，相比于助细胞，卵细胞的核较大，体型也较大（图3G）；2 个极核则位于胚囊中央的中央细胞中，并保持独立状态，受精前不发生融合（图3H）。

3 结论与讨论

3.1 结 论

腾冲红花油茶花芽分化经历分化始期、萼片形成期、花瓣形成期、雌雄蕊形成期、子房花药形成期、雌雄蕊成熟期等6 个时期。在分化期间，生长点由尖变圆，逐渐凹陷、平展，直至分化出子房花药。子房有3 ～ 4 个心室，每个心室多枚胚珠，倒生胚珠，胚珠发育属于薄珠心型。腾冲红花油茶为四孢子胚囊，胚囊发育为五福花型，在胚囊发育过程中珠心组织被溶解吸收。

3.2 讨 论

腾冲红花油茶花芽分化期间，生长点由尖变圆，逐渐凹陷、平展，直至分化出子房花药。于次年1 月期间，雌雄蕊发育成熟，花朵开放，标志着腾冲红花油茶花芽分化结束。从试验结果来看，腾冲红花油茶花芽分化进程与普通油茶差异不大，分化进程的时期划分与袁德义等[21] 对“湘林一号”普通油茶的花芽分化时期划分稍有差异。普通油茶C. oleifera Abel 花芽分化从5 月末开始，10 月初结束，历时4 个月；广宁红花油茶C. semiserrata Chi. 于4 月份开始进行花芽分化，9 月结束，历时5 个月；高州油茶C. gauchowensisChang 花芽分化时期为5 月中旬—10 月中旬，历时5 个月[22-24]。腾冲红花油茶于5 月上旬开始进行花芽分化，次年1 月结束，历时8 个月。由此可知，相比于其他种类的油茶植物，腾冲红花油茶花芽分化时间相对较长，且历经较长时间的低温环境。而花芽分化是内外因素共同作用、相互协调的结果，其分化期的长短由植物发育特性与环境条件决定[25]。所以说腾冲红花油茶花芽分化时间较长，与其遗传特征息息相关，可能也与外界环境有关。比如腾冲红花油茶花芽分化期间要经历较长时间的低温环境，也许正是因为低温的诱导而使花芽分化的时间延长，但是其分化时长与低温环境之间的具体关系，还有待进一步研究。

腾冲红花油茶子房有3 ～ 4 个心室，每个心室有多枚胚珠，为倒生胚珠，每枚胚珠发育状况不一致，胚珠发育属于薄珠心型。胚珠是被子植物雌配子体的载体，在植物有性生殖过程中占有十分重要的地位[26]。腾冲红花油茶子房成熟之后，7 月中旬胚珠原基开始突起，前端发育形成珠心，末端发育形成珠柄。继而出现的环状突起慢慢包裹珠心形成珠被，最终形成具有内外珠被和珠心的成熟胚珠。

在腾冲红花油茶孢原细胞发育为大孢子母细胞的过程中，发现了珠心细胞开始溶解的现象。姚家琳、付春华等[27] 在对李Prunus salicina Lindl胚胎发育败育现象的研究中发现，在植物雌蕊发育过程中，合子的异常分裂和珠心、珠被的提早退化都会造成胚珠败育。但是大多数被子植物胚囊的整个表面都具有吸收机能，可以消化邻接的珠心细胞以及珠被内层细胞[28]。在试验结果中，孢原细胞发育为大孢子母细胞的过程中发现了珠心组织被溶解吸收的现象，而在后期大孢子母细胞发育为成熟雌配子体的胚囊过程中，都未见珠心组织。由此可见，腾冲红花油茶的雌配子体发育过程中，珠心细胞有可能会被胚囊消化吸收。但在普通油茶与其他油茶植物生殖生物学的研究中，都未见相关描述。因此，腾冲红花油茶珠心组织被胚囊吸收的特性与普通油茶和其他油茶植物是否不一致，还有待深入研究。

腾冲红花油茶为四孢子胚囊，胚囊发育为五福花型，其胚囊发育类型与普通油茶、攸县油茶C. yuhsienensis 的葱型胚囊有明显差异。9 月初，珠心中央的薄壁细胞迅速分裂形成孢原细胞，孢原细胞继续发育形成大孢子母细胞。腾冲红花油茶雌配子体发育从大孢子母细胞开始，由大孢子母细胞进行两次减数分裂形成4 个功能大孢子，进而发育成为4 核胚囊。接着，4 个功能大孢子进行有丝分裂，形成7 细胞8 核胚囊。7 细胞8 核胚囊中卵细胞与两个助细胞呈品字型排列在珠孔端，两个极核位于胚囊中间，未受精之前不发生融合，3 个反足细胞位于合点端，整齐排列。在何春燕[29]对普通油茶和邹锋[30] 对攸县油茶的观察研究发现普通油茶与攸县油茶的大孢子母细胞进行第一次减数分裂后形成二分体，二分体中靠近珠孔端的细胞退化，保留的二分体继续完成减数第二次分裂，形成具有双核的单细胞胚囊。而后，双核移向胚囊两端，进行两次有丝分裂后，最终形成7细胞8 核胚囊。该种胚囊发育为葱型，属于双孢型胚囊。由此可见，腾冲红花油茶胚囊发育与普通油茶、攸县油茶胚囊发育有显著差异。但是，腾冲红花油茶最终形成胚囊中的7 细胞的排列方式与普通油茶、攸县油茶一样。

被子植物胚囊的发育类型演化为由单孢子胚囊类型发展到双孢子胚囊类型，再进一步发展到四孢子胚囊类型[31]。所以，从胚囊的发育演化的进程来看，腾冲红花油茶胚囊发育方式比普通油茶、攸县油茶更为进化。另外，由试验结果得出腾冲红花油茶雌配子体发育从9 月中旬开始，于当年12 月—次年1 月左右结束。可知，腾冲红花油茶花芽分化历经较长时间的低温环境时期正值雌配子体发育期，且此时珠心组织被溶解吸收。由此可推测，腾冲红花油茶花芽分化能够经历较长环境的低温与其胚囊发育类型息息相关，但是其具体的关系还需要深入研究探讨。

综上所述，作为一种外形特征、地理分布与普通油茶有极大差异的物种，腾冲红花油茶在配子体发育上也存在其独特性。腾冲红花油茶花芽分化相对于普通油茶、广宁红花油茶、高州油茶来说历时较长，且历经了较长时间的低温环境。从各分化时期的内部特征看，腾冲红花油茶在雌配子体发育前的各个阶段内部结构特征与普通油茶差异不大，但是胚囊的发育类型却有较大差异。而由于腾冲红花油茶生活在高黎贡山西南麓，该地区纬度低、光照强、海拔相对较高及冬季温度较低等复杂环境，与其他油茶植物生活的环境存在很大差别，可能为适宜该地理气候，腾冲红花油茶进化出比较特殊的胚囊发育方式以应对复杂的地理环境气候。所以，从胚囊发育类型演化来看，腾冲红花油茶比其他种类油茶植物更为进化，而这些进化特征也许是正是为了适应更加复杂的环境，这方面还需开展进一步研究以获得更多的数据支持。由此，腾冲红花油茶下一步的研究方向应是探索其花芽分化和雌配子体发育方式与其他种类油茶有显著不同的原因，以及其特殊的胚囊发育方式与复杂环境之间的关系。

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[ 本文编校：赵 坤]