低温和5—氮胞苷对油菜花芽分化和DNA甲基化的影响

宋峥 喻艳 汪瑞清

摘要：

以中油杂11号（Brassica napus L.）为材料，采用不同时间低温处理油菜幼苗，不同浓度5-氮胞苷（5-azaC）药液处理油菜萌动种子，通过观察茎尖花芽分化进程并测定茎尖DNA甲基化水平，研究了低温和5-azaC对油菜花芽分化和茎尖DNA甲基化的影响。结果表明，6℃低温处理幼苗6、12、18d能促进油菜花芽分化;50μmol/L 5-azaC处理萌动种子促进油菜花芽分化，且与低温促进花芽分化的作用具有加成作用;250、500μmol/L[JP] 5-azaC处理萌动种子抑制油菜花芽分化;低温和5-azaC处理均能降低茎尖DNA甲基化水平。说明低温降低油菜植株茎尖DNA甲基化水平并促进花芽分化;低浓度5-azaC具有代替低温促进油菜花芽分化的作用;甘蓝型油菜为种子春化植物;幼苗比萌动种子更容易受到低温处理的影响。

关键词：

油菜;5-氮胞苷;低温;花芽分化;DNA甲基化

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：1019754/jnyyjs20190315011

油菜生长发育过程中需要经历低温春化才能从营养生长转变到生殖生长阶段[1]，花芽分化是生长转变完成的标志。近年来，植物生长转变研究的热点之一是转变过程中DNA甲基化水平的变化及其影响因素[2-5]。5-氮胞苷（5-azaC）是一种去甲基化试剂，在DNA复制过程中能取代胞嘧啶核苷加入到DNA新链中，由于嘧啶环上甲基结合部位被氮原子占据，导致DNA链不能被甲基修饰而去甲基化。对模式植物拟南芥开花研究的结果表明，低温、5-azaC和赤霉素都可促进其开花[6]。油菜生长发育与DNA甲基化的研究还很少。本文研究5-azaC和低温对油菜花芽分化和茎尖DNA甲基化的影响，以期能为油菜生长转变机理研究提供理论依据。

1材料与方法

11材料

采用甘蓝型油菜（Brassica napus L.）中油杂11号为试验材料（中国农科院油料作物研究所选育并提供）。5-azaC购自Sigma公司。试验于2007[CD1]2008年度在华中农业大学试验田进行。

12幼苗低温处理

10月17日大田直播。11月13日将幼苗移栽于4个苗盆（40cm×30cm×25cm）置于室内，其中3盆分别于0（当日）、6、12d后置于6℃光照培养箱，室内光照条件与培养箱中相同。18d后将全部幼苗移栽回大田，即低温处理时间分别为18、12、6、0d（CK），记为T3、T2、T1、CK1。每处理种植1小区，顺序排列，小区面积14m2，密度11000株/667m2。

处理结束当日每处理取10株幼苗茎尖于-80℃冰箱保存，用于测定DNA甲基化水平。DAT（移栽后天数，days after transplanted）12开始，每4d每小区取7株茎尖，解剖镜下观察花芽分化。

13萌动种子5-azaC处理

10月21日将种子均等置于室内4个铺有滤纸的发芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后将萌发种子置于20℃光照培养箱中，每2d添加1次5-azaC药液，浓度分别为0（CK）、50、250、500μmol/L，记为CK2、C1、C2、C3。10d后用清水替代5-azaC药液。15d后将子叶期幼苗移栽入大田。每处理种植1小区，顺序排列，小区面积及移栽密度同12。

處理结束当日每处理取10株子叶期幼苗茎尖于-80℃冰箱中保存，用于测定DNA甲基化水平。DAT35开始每4d每小区取7株茎尖，解剖镜下观察花芽分化。[JP]

14萌动种子5-azaC加低温处理

10月21日将种子均等置于室内4个铺有滤纸的发芽盒（12cm×12cm×5cm）中清水催芽。3d后将萌发种子置于6℃光照培养箱中，每2d添加1次5-azaC药液，浓度分别为0（CK）、50、250、500μmol/L，记为CK3、C4、C5、C6。10d后将发芽盒转移至20℃光照培养箱，用清水替代5-azaC药液。15d后将子叶期幼苗移栽入大田。每处理种植1小区，顺序排列，小区面积及移栽密度同12。

取样方法同13。

15花芽分化进程

通过解剖镜观察并参照刘后利[7]油菜花芽分化的分级标准确定花芽分化级别。采用公式1计算花芽分化指数以确定花芽分化进程。

花芽分化指数=∑cfn公式1

注：c-分化级别（1级：生长点膨大，无花原基;2级：具1-5个花原基;3级：花原基进一步增多;4级：花原基伸长;5级：花萼原基分化）;f-每级别分化株数;n-观察总株数

16茎尖DNA甲基化水平测定

DNA提取：参照李合生[8]CTAB法提取茎尖DNA。

DNA浓度和纯度检测：采用紫外分光光度法比色检测DNA的浓度和纯度。

DNA水解：参照吴筱丹[9]的方法水解DNA。

DNA甲基化水平测定：参照吴筱丹[9]高效液相色谱法（HPLC）测定DNA甲基化水平，并作部分修改。色谱柱：Varian C18柱;流动相：甲醇-5mmol/L庚烷磺酸钠-三乙胺（10∶90∶02，v/v），pH=40，流速为07ml/min;检测器波长：273nm。

2结果与分析

21低温处理幼苗对油菜花芽分化的影响

DAT12所有处理花芽分化指数均为100，花芽分化未开始（图1）。DAT16 T3花芽分化开始。DAT20 T2花芽分化开始。DAT24所有处理都已经开始花芽分化，此时花芽分化指数T3>T2>T1>CK1。DAT28各处理花芽分化指数比较结果同DAT24。

各处理中T3分化进程最快，其次是T2、T1，CK1分化进程最慢。说明本试验范围内，低温处理油菜幼苗能促进茎尖花芽分化，且低温处理时间越长，促进效果越好。

22 5-azaC处理萌动种子对油菜花芽分化的影响

DAT35所有处理花芽分化均未开始（图2）。DAT39 C1花芽分化开始。DAT43所有处理都已经开始花芽分化，此时花芽分化指数C1>CK2>C2>C3。DAT47、DAT51各处理花芽分化指数比较结果同DAT43。

各处理中C1分化进程最快，其次是CK2、C2，C3分化进程最慢。说明本试验范围内，低浓度5-azaC处理油菜萌动种子能促进茎尖花芽分化，而中高浓度5-azaC处理则抑制了茎尖花芽分化，且浓度越高，抑制效果越明显。

23 5-azaC加低温处理萌动种子对油菜花芽分化的影响

DAT35所有处理花芽分化均未开始（图3）。DAT39所有处理都已经开始花芽分化，此时花芽分化指数C4>CK3>C5>C6。DAT43、DAT47各处理花芽分化指数比较结果同DAT39。

各处理中C4分化进程最快，其次是CK3、C5，C6分化进程最慢。说明本试验范围内，低浓度5-azaC加低温处理油菜萌动种子能促进茎尖花芽分化，而中高浓度5-azaC加低温处理则抑制了茎尖花芽分化，且浓度越高，抑制效果越明显。

对比DAT39～DAT51期间C1和C4处理结果，C4处理花芽分化指数均高于同一时期C1处理。说明本试验范围内，低浓度5-azaC与低温处理对促进茎尖花芽分化有加成作用。

对比39～51 DAT期间CK2和CK3处理结果，CK3处理花芽分化指数均高于同一时期CK2处理。说明本试验范围内，低温处理油菜萌动种子也能促进茎尖花芽分化。

24低温处理幼苗对茎尖DNA甲基化的影响

油菜幼苗经不同时间低温处理后，茎尖DNA甲基化水平均低于未处理的对照（表1），T1、T2、T3较对照分别下降了1868%、2173%和2668%。各处理与对照差异显著，其中T3与对照差异极显著。说明本试验范围内，低温处理油菜幼苗能降低茎尖DNA甲基化水平，且处理时间越长，下降幅度越大。

25 5-azaC处理萌动种子对茎尖DNA甲基化的影响

DNA甲基化水平均低于未处理的对照（表1），C1、C2、C3较对照分别下降了3094%、2818%和2405%。C1、C2与对照差异显著，C3与对照差异不显著。说明本試验范围内，5-azaC处理油菜萌动种子能降低茎尖DNA甲基化水平，低浓度处理下降幅度大于中高浓度处理。

[BT（2+1]265-azaC加低温处理萌动种子对茎尖DNA甲基化的影响[BT）]

油菜萌动种子经不同浓度5-azaC加低温处理后，茎尖DNA甲基化水平均低于未处理的对照（表1），C4、C5、C6较对照分别下降了4038%、3492%和3129%。各处理与对照差异显著。处理之间差异不显著。说明本试验范围内，5-azaC加低温处理油菜萌动种子能降低茎尖DNA甲基化水平，低浓度处理下降幅度大于中高浓度处理。

对比C1～C6同浓度处理结果，茎尖DNA甲基化水平C4

对比CK2和CK3处理结果，茎尖DNA甲基化水平CK3

对比T1和CK3处理结果，油菜幼苗经过6d低温处理后茎尖DNA甲基化水平为3425%，萌动种子经过10d低温处理后甲基化水平为3773%。说明油菜幼苗比萌动种子更容易受到低温处理的影响。

3小结与讨论

31低温降低DNA甲基化水平

本试验表明低温处理萌动种子或茎尖降低油菜植株茎尖DNA甲基化水平并促进花芽分化，与李梅兰等[10]在白菜上研究结果相同。低温降低DNA甲基化水平致使花芽分化控制基因去甲基化后得到表达，促进花芽分化，或者通过提高植株内源赤霉素含量诱导植株提前抽薹，花芽分化提前[11]，也可能低温与赤霉素对花芽分化调控是两条独立途径[12]。

32花芽分化与DNA甲基化水平

本试验表明低浓度5-azaC能代替低温促进油菜花芽分化，且与低温处理有加成作用。与李梅兰等[6]、汪炳良等[13]在白菜、萝卜上研究结果相同。5-azaC降低植株DNA甲基化水平进而促进花芽分化，与低温处理的加成作用可能正是因为两者具有相同的作用途径。甲基化水平下降可以促进花芽分化，但也会对植株产生其它影响，中高浓度5-azaC对植株产生了一定的毒害作用，造成植株体内代谢紊乱，从而抑制了花芽分化。

33甘蓝型油菜春化类型

本试验表明6℃低温处理中油杂11号萌动种子10d后植株花芽分化进程较未经低温处理的植株提前，说明萌动种子也能接受低温诱导从而导致植株提前花芽分化，证明甘蓝型油菜为种子春化植物，与冬小麦、萝卜、白菜等[14]相同，与绿体春花植物甘蓝[14]不同。

34低温处理与植株大小

本试验表明油菜幼苗经过6℃低温处理6d后DNA甲基化水平相比萌动种子经过6℃低温处理10d后更低。说明油菜幼苗比萌动种子更容易受到低温处理的影响。植株幼苗各种生理代谢活动比萌动种子活跃，接受外界刺激的应激反应也更强烈，因而更容易受低温处理影响。

参考文献

[1]

丁秀绮.白菜型春油菜花芽分化研究[J].作物学报，1990，16（1）：83-90.

[2] Finnegan E J， Peacock W J， Dennis E. DNA methylation， a key regulation of plant development and other processes[J]. Cur Opion in Genet and Develop， 2000（10）： 217-223.