气相色谱法测定吡唑硼酸频哪酯及方法学验证

王武宝，高思国，刘水莲，范荣荣，任耀辉，马 雪，张 雨

(济南尚博医药股份有限公司，山东 济南 250204)

有机硼化合物的Suzuki反应在有机合成和组合化学等领域应用十分广泛，这是因为其独特的结构特征和良好的生物活性和药理作用[1-3]。吡唑基团存在于大量的天然和合成的小分子配体中，可与多种具有药理重要性的酶和受体相互作用，被广泛应用于合成潜在的酶抑制剂、癌症的硼中子俘获治疗法等，在抗肿瘤药物开发方面有着重要意义[4-5]。烷基吡唑硼酸是合成很多具有生物活性化合物的重要中间体。作为反应原料与频哪醇缩合成酯后，其稳定性提高，可长期储存，更便于用作有机合成的重要试剂和进一步的药物相关活性的研究。吡唑硼酸频那醇作为吡唑硼酸频那醇酯类的重要中间体之一，具有非常可观的发展前景，更能广泛地应用于生物医药行业。但是，目前未有相关文献报道检测吡唑硼酸频哪酯的方法。本文建立一种气相色谱法，操作简单，经验证，该方法结果准确，可用于检测吡唑硼酸频哪酯。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B气相色谱仪(安捷伦公司)；Agilent 7890B气相色谱仪(安捷伦公司)；XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多国际有限公司)；5%苯基-甲基聚硅氧烷(30 m×φ0.25 mm，0.25 μm)色谱柱(安捷伦公司)。

吡唑硼酸频哪醇酯，济南尚博医药股份有限公司，批号2105；二氯甲烷，山东金岭化工股份有限公司，批号21024；四氢呋喃，潍坊振兴日升化工有限公司，批号2010；吡唑，济南安科诺新材料有限公司，批号3003；色谱纯乙腈(TEDIA)。

1.2 检测方法

色谱柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷(30 m×φ0.25 mm，0.25 μm)；检测器：氢离子火焰检测器；载气：氮气；流速：1.0 mL/min；进样器温度：215 ℃；检测器温度：295 ℃；分流比：3∶1；进样量：0.1 μL；柱箱温度：初始 50 ℃，维持 2 min，按 10 ℃/min 升温至 150 ℃，维持 0 min，按 30 ℃/min 升温至 260 ℃，维持 5 min；氢气流速：30 mL/min；空气流速：300 mL/min；氮气流速：25 mL/min。

对照品溶液制备：精密称定 1.0 g 吡唑硼酸频哪醇酯样品置于 10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解后定容至刻度线，摇匀，作为对照品溶液。

1.3 方法学验证

1.3.1 专属性

二氯甲烷溶液制备：移取约 10 mL 稀释剂，置于 25 mL 容量瓶中，再精密称定 2.5 g 二氯甲烷，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度线，摇匀。

四氢呋喃溶液制备：移取约 10 mL 稀释剂，置于 25 mL 容量瓶中，再精密称定 2.5 g 四氢呋喃，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度线，摇匀。

吡唑溶液制备：移取约 10 mL 稀释剂，置于 25 mL 容量瓶中，再精密称定 2.5 g 吡唑，置于容量瓶中，溶解后定容至刻度线，摇匀。

对照品溶液制备：精密称定 2.5 g 吡唑硼酸频哪醇酯样品，置于 25 mL 容量瓶中，用稀释剂溶解后定容至刻度线，摇匀。

混合溶液制备：分别精密移取 1 mL 二氯甲烷溶液、四氢呋喃溶液和吡唑溶液，置于 10 mL 容量瓶中，加对照品溶液稀释定容至刻度线，摇匀。

分别取空白溶液(乙腈溶液)、二氯甲烷溶液、四氢呋喃溶液、吡唑溶液、对照品溶液及混合溶液，各进1针，记录气相色谱图，获得各成分主峰的保留时间。

1.3.2 重复性

重复性试验中供试品溶液制备：精密称定6份吡唑硼酸频哪醇酯，分别置于 10 mL 容量瓶中，每份 1.0 g。加稀释剂溶解后，定容至刻度线，摇匀。依次进样分析，记录气相色谱图，获得各份吡唑硼酸频哪醇酯的峰面积，计算吡唑硼酸频哪醇酯的质量分数。

1.3.3 线性

线性试验中供试品溶液制备：精密称定 10.0 g 吡唑硼酸频哪醇酯，置于 50 mL 容量瓶中，加稀释剂溶解后定容至刻度线，摇匀，配制成质量浓度为 200 mg/mL 的溶液。分别移取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL 的溶液至 10 mL 容量瓶中，用稀释剂再次稀释定容至刻度线，摇匀，作为线性系列试验溶液，标记为A(80%)、B(90%)、C(100%)、D(110%)、E(120%)。各进1针，记录气相色谱图，获得不同质量浓度吡唑硼酸频哪醇酯的峰面积。以峰面积与相应质量浓度比值进行线性回归，得到回归方程。

1.3.4 中间精密度

中间精密度试验中供试品溶液制备：分析员A和B于第一天分别精密称定3份吡唑硼酸频哪醇酯，置于 10 mL 容量瓶中，每份1.0 g，加稀释剂溶解后定容至刻度线，摇匀，依次进样分析；第二天分析员A按相同方法再配制3份供试品溶液，分别用两台仪器检测，依次进样分析；记录气相色谱图，获得不同人员、不同时间、不同仪器下吡唑硼酸频哪醇酯的峰面积，计算各条件下吡唑硼酸频哪醇酯的纯度及RSD值。

1.3.5 溶液稳定性

溶液稳定性试验中供试品溶液制备：精密称定 1.0 g 吡唑硼酸频哪醇酯，置于 10 mL 容量瓶中，加稀释剂溶解后定容至刻度线，摇匀，于配制后0、1、2、3、6、12 h 依次进样分析，记录气相色谱图，获得不同进样时间下吡唑硼酸频哪醇酯的峰面积，计算纯度结果相对于 0 h 的变化。

2 结果与分析

2.1 专属性结果

空白溶液中的峰对样品检测无明显干扰，混合溶液中吡唑硼酸频哪醇酯和其他杂质都能被有效分离，产物峰前后分离度大于1.5(如表1所示)，专属性试验通过。

表1 专属性试验结果

2.2 重复性结果

通过计算供试品的纯度，6针RSD值为0.002%(如表2所示)，小于2%，重复性试验通过。

表2 重复性试验结果

2.3 线性结果

线性回归方程为Y=285X-1923.4，相关系数为0.9985，大于0.95(如表3所示)，线性试验通过。

表3 线性试验结果

2.4 中间精密度结果

通过计算供试品的纯度，不同分析员同一天测定结果RSD值为0.010%，同一分析员不同天测定结果RSD值为0.007%，同一分析员不同仪器测定结果RSD值为0.027%(如表4、表5、表6所示)，均小于2%，中间精密度试验通过。

表4 中间精密度试验结果1

表5 中间精密度试验结果2

表6 中间精密度试验结果3

2.5 溶液稳定性结果

供试品溶液 0、1、2、3、6、12 h 纯度结果相对于 0 h 的变化，均在0.5%以内，12 h 内溶液稳定(如表7所示)，稳定性试验通过。

表7 溶液稳定性试验结果

3 结论

采用气相色谱法测定吡唑硼酸频哪酯，并进行了方法学验证，包括专属性、重复性、线性、中间精密度和溶液稳定性，结果表明，该方法能够准确测定吡唑硼酸频哪酯的有关物质，且方法操作简单、准确。