雷公藤内酯醇乏氧激活前药的合成与结构表征*

张冬梅，阙慧卿，李 唯

(福建省医学科学研究院 福建省医学测试重点实验室，福建 福州 350001)

有充足氧气供给的肿瘤细胞会快速异常增殖，然而，快速异常增殖所需要的高耗氧量又会导致氧气供应不足。氧气供应不足导致肿瘤缺氧环境的形成[1]。缺氧可以通过激活肿瘤细胞内相关基因和蛋白改变，促进肿瘤的发展，使肿瘤产生耐药性方面[2-3]。因此缺氧作为肿瘤的主要特征，是药物研发所面临的问题[4-6]。

雷公藤内酯醇在1972年从雷公藤中提取出来，是一个结构独特的二萜类化合物[7]。雷公藤内酯醇具有广泛的很强的抗肿瘤、抗炎、抗免疫活性。雷公藤内酯醇除了显示出很强的抗肿瘤活性外，还显示出广谱的抗肿瘤活性，在体内外对多种肿瘤有效[8-10]。就多因素引起的肿瘤耐药性来说，雷公藤内酯醇可以作用于多个信号通路，具有抗肿瘤耐药性的特点[11]。然而，雷公藤内酯醇的选择性差、毒性大，导致在临床上的应用受到限制。为了达到降低雷公藤内酯醇毒性的目的，将前药策略应用在雷公藤内酯醇上应该是一个有效的解决方法[12-16]。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

实验仪器包括：电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9070A)、分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号：LE104E/02)、定时恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂有限公司，型号：90-2)、薄膜旋转蒸发器(上海，型号：B-220)、循环冷却器(上海-恒科学仪器有限公司，型号：BWR-03A)、核磁共振仪(德国布鲁克、型号：Ascend 400)、循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司，型号：SHZ-D )、EYEAL高温反应槽(JAPAN，型号：PS-1000)。

实验试剂包括：雷公藤内酯醇(福建省医学科学研究院)、阿霉素(罗恩试剂，97%)、吉它西滨(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、2-硝基咪唑(罗恩试剂，97%)、3-溴丙酸乙酯(罗恩试剂，98%)、碘化钾(罗恩试剂，AR)、碳酸钾(罗恩试剂，AR)、N，N-二甲基甲酰胺(上海麦克林生化科技股份有限公司，AR)、甲醇(罗恩试剂，AR)、氢氧化锂(罗恩试剂，98%)、二氯甲烷(罗恩试剂，AR)、乙酸乙酯(罗恩试剂，AR)、N，N’-二环乙基碳二亚胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，99%)、4-二甲氨基吡啶(罗恩试剂，99%)。

1.2 化合物1、Dox1和Gem1的合成

化合物1、Dox1和Gem1的合成路线如图1所示。

图1 化合物1、Dox1和Gem1的合成路线图

1.3 实验操作

1.3.1 3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯(1-1)的合成

将2-硝基咪唑 (0.018 moL，2 g)、 3-溴丙酸乙酯 (0.027 moL，3.46 mL)、 碘化钾 (0.009 moL，1.49 g) 和适量碳酸钾装入 25 mL 圆底烧瓶中，加入干燥N，N-二甲基甲酰胺8 mL，加热 100 ℃，搅拌 2 h。反应结束，后处理，湿法过柱 [V(二氯甲烷)∶V(乙酸乙酯)=100∶5]，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯，收率为54%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.63(2H，t，J=7.2)，3.6(3H，s)，2.95(2H，t，J=7.2)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C8H11NaN4O3，236.0750；Found，236.0750。

1.3.2 3- (2-硝基-1H-咪唑-1-基) 丙酸 (1-2)的合成

将3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸乙酯溶解于甲醇-水[V(甲醇)∶V(水)=5∶1]溶液中，缓慢加入氢氧化锂2.59 mL，将反应混合物室温搅拌过夜。真空除去有机溶剂，用浓盐酸调pH值至偏酸性，得3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸白色沉淀。过滤，烘干得白色固体，收率为80%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.65(1H，d，J=0.96)，7.16(1H，d，J=0.96)，4.58(2H，t，J=6.9)，2.85(2H，t，J=6.9)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C6H7NaN4O3，208.0437；Found，208.0436。

1.3.3 目标产物(1)的合成

取雷公藤甲素(0.1 mmoL，50 mg)溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，搅拌条件下加入N，N’-二环乙基碳二亚胺(0.1 mmoL，20.6 mg)和催化量4-二甲氨基吡啶，搅拌30 min。将3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸溶解于干燥N，N-二甲基甲酰胺2 mL中，加入到溶有雷公藤甲素的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，继续搅拌过夜。反应结束，后处理，湿法过柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶2]，得到目标产物，收率为60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)，4.91-4.78(2H，m)，4.31-4.30(1H，m)，4.21(2H，t，J=6.48)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)，2.73(2H，t，J=6.48)，2.69-2.67(1H，m)，2.34(1H，q，J=6.84)，2.20-2.13(2H，m)，2.00-1.96(m，1H)，1.89-1.84(1H，m)，1.41-1.38(1H，m)，1.28-1.23(1H，m)，0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C26H29NaN9O3，550.1904；Found，550.1907。

1.3.4 Gem1的合成

方法同目标产物(1)的合成方法，吉西他滨、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二环乙基碳二亚胺和催化量4-二甲氨基吡啶，获得最终产物，收率为60%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：11.10(1H，s)，8.27(1H，d，J=7.56)，7.61(1H，s)，7.21(1H，d，J=7.56)，7.16(1H，s)，6.33(1H，d，J=5.94)，6.17(1H，t，J=7.02)，5.31(1H，s)，4.67(2H，t，J=6.48)，4.20-4.18(1H，m)，3.91-3.89(1H，m)，3.81(1H，d，J=12.36)，3.66(1H，d，J=12.36)，3.04(2H，t，J=6.48)；HRMS(ESI)calcd for[M+Na]+：C15H16NaF2N6O7，453.1049；Found，453.1050。

1.3.5 Dox1的合成

方法同目标产物(1)的合成方法，多柔比星、3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸、N，N’-二环乙基碳二亚胺和催化量4-二甲氨基吡啶，获得最终产物，收率为45%。1H-NMR(600 MHz，DMSO)δ：14.02(1H，s)，13.24(1H，s)，9.30(1H，s)，7.77-7.75(1H，m)，7.67-7.66(1H，m)，7.42(1H，d，J=7.56)，7.39-7.38(1H，m)，7.26(1H，d，J=7.56)，5.47(1H，s)，5.37(1H，s)，4.91(1H，s)，4.80(1H，s)，4.69(2H，s)，4.07-4.05(1H，m)，4.01(2H，t，J=6.48)，3.9(3H，s)，3.55-3.51(1H，m)，3.38-3.36(1H，m)，3.26-3.23(1H，m)，3.14-3.11 (1H，m)，2.66(2H，t，J=6.48)，2.27-2.24(1H，m)，2.01-1.98 (1H，m)，1.93-1.90 (1H，m)，1.69-1.64 (1H，m)，1.56-1.53(1H，m)，1.07(3H，s)；HRMS (ESI)calcd for[M+Na]+：C33H34NaN14O4，733.2072；Found，733.2073。

2 结果

雷公藤内酯醇是一个具有独特结构特征的三环二萜类化合物。确证结构中存在着三个关键官能团(一个α，β-不饱和内酯酮，三个环氧环，三个甲基)，再加上确证结构中其他氢信号在氢谱中的大致分布和氢的个数与标准的雷公藤内酯醇氢谱一致，就能确证此结构为雷公藤内酯醇。目标化合物是雷公藤内酯醇14-OH酯化产物。雷公藤内酯醇14-OH的信号消失，存在3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯的信号，再加上确证了雷公藤内酯醇的母核结构，就能确证目标化合物的结构。目标化合物的结构表征数据。 4.91至4.78存在多重裂缝的2个氢信号说明α，β-不饱和内酯酮中的活性亚甲基的存在，表明α，β-不饱和内酯酮的存在。4.31-4.30(1H，m)，3.87(1H，d，J=5.16)，3.40(1H，d，J=6)，2.97(1H，d，J=1.32)这几个信号表明三个环氧环的存在。0.96(3H，s)，0.91(3H，d，J=6.84)，0.79(3H，d，J=6.84)说明三个甲基的存在。其余谱图氢与标准谱图氢的分布类似，而且氢的个数相等，说明雷公藤内酯醇的母核结构正确。加之7.60(1H，d，J=7.56)，7.14(1H，d，J=7.56)两个硝基咪唑环上面的低场氢信号和两对脂肪氢的信号，说明14-OH上连接着3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸酯。综上确证了目标化合物的结构。

3 结论

本文合成了雷公藤内酯醇乏氧激活前药，并对所合成的目标化合物进行了结构确证。首先以2-硝基咪唑和具有强刺激性气味的3-溴丙酸乙酯为起始原料，通过亲核取代和水解两步反应，合成了3-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)丙酸。起先用酸在常温下水解酯键，但是当反应结束之后，用薄层层析板监测反应，发现反应完全，有杂质产生。因此使用碱在常温下水解酯键。缩合反应采用传统的Steglich酯化反应，但是分析纯的N，N-二甲基甲酰胺会很大程度的影响反应的进行。最后使用无水的N，N-二甲基甲酰胺，使得反应的收率提高。此外，还合成了两个对照品Gem1和Dox1，为后续的抗肿瘤研究提供了有效的支持。