降糖类中成药及保健品中添加的降糖类化学药品的定量检测方法

郝培娜

(郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451100)

近年来，随着人们生活质量的提高，在保障物质条件充裕的同时人们更加重视养生，尤其是糖尿病患者。对于糖尿病患者来说，服用降糖类药物是一个普遍现象。因为降糖药在临床上的使用十分广泛，其用量、效果也得到了广大医生、患者和媒体的认可。但从近年来的情况来看，降糖药所带来的副作用问题引起了人们注意[1]。许多降糖类药物具有潜在的健康风险。例如，增加体重、高血糖及胰岛素抵抗等问题发生的风险[2]；部分患者服用市面上的降糖药及降糖保健品容易引起低血糖情况，严重的甚至还会威胁患者的生命。此外，在使用部分降糖药进行治疗后，一些患者会出现低血糖反应[3-4]。由于部分中成药和保健品中含有降糖类化学药品，因此对该类药物进行定量检测显得十分必要。本次针对现有检测方法不准确的问题，提出了一种新的定量检测方法，希望可通过本研究为糖尿病患者后续治疗、选取药物提供文献参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈，色谱分析纯，山东满堂红新材料有限公司；甲醇，色谱分析纯，湖南宏建化工有限公司；格列喹酮，分析纯，上海源叶生物科技有限公司；格列本脲，分析纯，中国药品生物制品检定所；格列齐特，分析纯，中国药品生物制品检定所；格列美脲，分析纯，中国药品生物制品检定所；甲苯磺丁脲，分析纯，湖北猫尔沃生物医药有限公司。

1.2 仪器与设备

ROHS2.0型高效液相色谱仪，深圳市谱赛斯科技有限公司；岛津 228-63621-01型二极管阵列检测器，北京博耐奇光电技术有限公司；i-Process 6910型数据处理系统，上海晖望工贸有限公司；MACRK-UP20-40L型超纯水器，上海佰博康仪器有限公司；JC-QX-7.5L型超声波清洗器，青岛聚创环保集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样本前处理

1)对照溶剂制备

首先，完成降糖类药物对照溶液的制备。称取药品，精确到 0.01 mg。分别称取 22.86 mg 五种降糖类中成药及保健品常添加的化学组分，放入同一量杯中。量杯规格为 100 mL。加入甲醇，超声溶解并定容，完成对照溶剂的制备[5-6]。吸取 2 mL 标准对照溶剂，倒入 25 mL 量瓶中，甲醇溶液定容，得到标准的对照品溶液。

2)供试品溶剂制备

选取郑州市各县市、区食品药品监督管理局需要市场监督抽查的宣传具有降血糖作用的片剂、硬胶囊剂和颗粒剂的各种类型、规格的产品作为研究对象。将患者一次口服剂量的药物研磨后添加 20 mL 三氯甲烷，设置超声波清洗机功率参数为 800 W，频率为 100 kHz，对药品进行超声处理 10 min，过滤后将滤液抽干，向残留物中添加甲醇和三氯甲烷各 1 mL 以达到溶解目的，以此来完成试验溶液的制备[7]。

1.3.2 液相色谱条件

本实验选取Poroshell120EC-C18柱作为色谱柱(100 mm×φ2.1 mm，2.7 μm)。色谱柱温度 30 ℃，5 mmol/L 升的醋酸铵水和乙腈为流动相，流速 0.3 mL/min，将进样量 5 μL[8]。

1.3.3 质谱条件

本实验采用电喷射电离离子源开展实验，正、负离子同时扫描。检测模式MRM，毛细管温度 350 ℃；鞘气流速 12 L/min[9]；辅助气空气流速 3 L/min；喷射电压在2500～3000 V。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围、相关系数、检出限及定量限

对本次实验选取的五种不同的降糖类化学组分进行分析，线性回归法测定峰面积和质量浓度，完成相关系数和线性方程的确定。在5个试验对象中分别加入4个不同的阴性样品，完成S/N=3条件下检出限和S/N=10条件下定量限的确定。表1给出了各个成分的线性范围、相关系数、检出限和定量限。

表1 线性范围、检出限及定量限分析

格列喹酮、格列本脲、格列齐特、格列美脲、甲苯磺丁脲五种药物的的线性范围在10～1900 ng/mL 之间，相关线性相关系数(r2)均不小于0.99。检测其组分的定量限和检出限，其结果分别为0.0010～0.0050 mg/kg 和0.0014～0.0090 mg/kg。

2.2 供试样品测定

选取郑州市各区市药品监督管理局提供的7种、28批市面上售卖的降糖类中成药及保健食品作为样品，采用方法进行检测，结果如表2所示。

表2 阳性样品检测结果

由表2可知，一共检出7份阳性药品(格列本脲、格列美脲、瑞格列奈、格列齐特)。为验证所提方法检测的准确性，分别采用HPLC-DAD方法和HPLC-MS/MS分析方法对其进行了充分检验，检验了方法的有效性。结果表明，二次检验结果与设计方法的检验结果相符，准确率为100%，说明该方法能准确地检测到降糖类中成药及保健药品中的成分，并且检测结果基本相符，没有任何错误判断。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

本文采用 AgilentXDB-C18和 Agilent ZorbaxSB-C18两种液相色谱柱进行试验，探究不同体积分数、不同配比的乙腈、甲醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和磷酸等溶剂对梯度洗脱效果的影响。结果表明，在 AgilentZorbaxSB-C18作色谱柱的背景下，利用体积分数为0.02%的磷酸溶液(B)和乙腈(A)溶液进行梯度洗脱，可以较最好地分离出杂质。

3.2 样品提取溶剂的筛选

将待检测试样均匀地混合后，称量 1 g 样品，然后将其放入 50 mL 的离心管中，分别加入 10 mL 甲醇水溶液和体积分数为0.1%的甲酸-甲醇溶液，将其与丙酮溶液旋涡搅拌，搅拌时间不低于 2 min。搅拌完成后，5 min 离心，转速 7500 r/min。离心完成后，将 5 mL 上清液放入 20 mL 标准管中，放入 40 ℃ 环境下用氮气吹干。残余物用 1.0 mL 的甲醇进行溶解，用规格为 0.22 μm 的有机滤膜进行过滤，最终用 HPLC进行分析。结果显示，甲醇为最佳萃取条件，回收率均超过80%；采用其余溶液的萃取效果比较好，但其回收率仍然不理想，都小于80%。因此，以甲醇为萃取溶剂可实现5种不同的降糖成分检测，应用效果更好。

3.3 固相萃取柱的选择

为优化检测质量，对 MCX、 SCX、NH2、EVNI-CARB/LC-NH2、C18等不同色谱柱的应用效果进行对比。在使用之前，先用甲醇 5 mL、二氯甲烷 5 mL 进行萃取柱活化，然后用 5 mL 甲醇-二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷 5 mL、二氯甲烷 2 mL 完成洗小柱，然后抽空，用 5 mL 甲醇-二氯烷-冰乙酸进行洗脱。称量 1 g 药剂放入离心管中，向其加入甲醇 10 mL 后搅拌，搅拌时长 2 min，30 min 超声波，取 5 mL 上清液放入离心管中以 7500 r/min 的速度离心，在 40 ℃ 下用氮气吹干并溶解残留物，之后再加 1.8 mL 二氯甲烷用固相萃取柱进行洗脱。经过 0.22 μm 的有机滤膜后用高效液相色谱法进行分析，得到的结果如图1所示。

图1 固相萃取柱的净化效果

研究发现，MCX柱在纯化过程中，某些药物的洗脱效果不明显，回收率仅为50%；而 SCX柱对5种药剂的洗脱效果同样不明显，且回收率小于50%。由此可证明，在本文选定的五种降糖类保健品常添加组分，如甲基磺丁脲、格列本脲等的定量检测过程中，MCX和 SCX都不适合。C18柱具有良好的清除作用，而且工艺简单、回收率、重现性、稳定性好，但当降糖药物添加茶物质作为保健品时由于其内部含有杂质，其净化作用不大。而NH2柱的纯化可很好地去除添加茶物质作为降糖保健品的杂质，且回收率高。因此，可选用C18固相萃取柱检测降糖茶之类的保健品，用NH2固相萃取法检测降糖茶中的化学成分。

4 结束语

本实验研究了五种常用降糖类化学药品，并对其含量进行了测定。该方法主要从三个方面对常见方法进行了优化，对其色谱实验中选用的色谱柱进行优化选取，对其梯度洗脱条件进行进一步优化，以甲醇为萃取溶剂，选用C18固相萃取柱检测除降糖茶之外的药品，用NH2固相萃取法检测降糖茶中的化学成分，由此完成其条件优化，利用实验证明其先进性。该方法具有良好的稳定性和重现性，对具有降糖效果的中成药及保健品进行部分药物组分的定量检测，可以满足对该类药物含量分析的要求，具有一定应用价值。