酶水解柴胡皂苷B1 制备稀有前柴胡皂苷A 的研究

徐天真，吴梦茹，邵佳丽，常 悦，朱烨婷，陈季璇，陈璐阳，陈登艳，杨 欢，夏国华*

（1.如皋市人民医院药剂科，江苏 如皋 226500； 2.南通大学附属如皋医院药剂科，江苏 如皋 226500；3.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013）

中药柴胡是伞形科植物柴胡BupleurumchineseDC.或狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，分别习称“北柴胡” 和“南柴胡”［1］，用药历史悠久，始载于《神农本草经》，性辛、苦，微寒，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，具有抗肿瘤、抗炎等药理作用［2-5］，其齐墩果烷型分子结构较大，限制了其通过口服吸收进入体循环。前柴胡皂苷A 是柴胡皂苷B1脱除一分子葡萄糖基后的次级苷［6-8］。现代药理研究表明，前柴胡皂苷的药理活性高于其原生苷［9］，且更易被小肠吸收，因此研究者围绕该类中药活性成分的制备技术开展了一些研究，主要有化学法、微生物转化法［10-12］。但是由于其在原植物中的含量很低，传统色谱分离手段难以大量制备； 化学法的副产物较多且废水污染严重； 微生物转化法亦存在副产物较多、反应条件难以控制等不足；而酶水解法反应条件温和，特异性强，已被广泛地应用于多种中药苷类活性成分的转化反应［13-16］。因此，本文通过酶水解柴胡皂苷B1获取前柴胡皂苷A，进而采用单因素和响应面实验对水解条件进行考察及优化，建立了关键技术，从而为大量制备前柴胡皂苷系列成分以开展药理药效研究奠定基础。

1 材料

HP1100 型高效液相色谱仪（HPLC，美国Agilent 公司）； HRQ-3110 型涡旋混匀器（美国Silentshake 公司）；85-2 型控温磁力搅拌仪（江苏金怡仪器科技有限公司）；AL-104 型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； LXQ型电喷雾质谱（ESI-MS，美国Thermo Fisher Scientific 公司）； Advance Ⅱ型核磁共振仪（NMR，400 MHz，德国Bruker 公司）。

柴胡皂苷B1（纯度≥98.0%，批号18041708）由成都普非德生物技术有限公司提供。乙腈为色谱纯（美国Omni公司）； 甲醇、乙酸、乙酸钠均为分析纯（国药集团上海化学试剂有限公司）。β-葡聚糖苷酶（活力≥20 000 U／g）购自江苏金穗生物科技有限公司； β-葡萄糖苷酶（活力100 U／g）购自江苏锐阳生物科技有限公司； 纤维素酶（活力≥15 000 U／g，批号20190719）购自国药化学试剂有限公司； 柚苷酶（活力100 000 U／g，批号208008）由河南百康化工产品有限公司提供； 蜗牛酶（批号S20200421）购自合肥博美生物科技有限责任公司。

2 方法

2.1 色谱条件 Kromasil-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0 ～10 min，35% ～50% A； 10 ～20 min，50% ～60% A； 20 ～25 min，60% ～35% A）； 体积流量1.0 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长250 nm； 进样量20 μL。

2.2 标准曲线 精密称取柴胡皂苷B1对照品9.840 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得到质量浓度0.984 0 mg／mL 的对照品储备液。按照二倍稀释法制备得到一系列对照品溶液，0.20 μm PTFE 微孔滤膜过滤，取续滤液，在“2.1” 项色谱条件下测定。以柴胡皂苷B1质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝42.343X＋8.615 9 （R2＝0.999 1），在0.120 1～123.0 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3 酶水解柴胡皂苷B1分别吸取柴胡皂苷B1溶液和酶溶液（0.20 mol／L HAc-NaAc 缓冲液）置于离心管中，在一定温度下孵育一段时间。待反应结束后，向水解液中加入等体积甲醇，涡旋混匀。12 000 r／min 高速离心10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液用于HPLC 分析，以不加酶的反应体系为空白对照。

2.4 单因素试验 以柴胡皂苷B1转化率为指标，采用单因素实验考察了水解酶（β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、纤维素酶、蜗牛酶）、缓冲液pH （3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶-底物质量比（0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1）、反应温度 （30、40、50、60、70 ℃）和反应时间（12、24、36、48、60、72 h）对酶水解柴胡皂苷B1转化率的影响。

2.5 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验的基础上，以柴胡皂苷B1转化率为响应值，进行响应面实验设计（Design-Expert v8.0.6.1）； 此外，对预测所得最佳反应条件进行验证，并考察实际值与预测值的相对误差。响应面实验设计因素及水平见表1，模型回归方程为Y＝β0＋。式中Y为柴胡皂苷的转化率，β0为拦截系数，βi为线性项，βii为二次项，βij为交互项，Xi、Xj为自变量编码值（i≠j，i，j＝1，2，3，……，k）。

表1 因素水平

2.6 酶解产物的结构鉴定 酶水解结束后，通过反相柱层析对酶解产物进行纯化，并采用LC-MS、1H-NMR 和13CNMR 对其化学结构进行鉴定。

3 结果

3.1 HPLC 色谱图 按“2.1” 项下HPLC 分析条件对前柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1及其酶解液进行分析。如图1 所示，柴胡皂苷B1及其水解产物前柴胡皂苷A 均能得到较好地分离（R＞1.5）。

图1 柴胡皂苷B1 对照品（A）、前柴胡皂苷A 对照品（B）和柴胡皂苷B1 酶解液（C）的HPLC 色谱图（250 nm）

3.2 单因素试验结果

3.2.1 水解酶 如图2 所示，4 种酶均可以选择性地脱去柴胡皂苷B1末端的葡萄糖，生成前柴胡皂苷A，其中蜗牛酶所得的转化率远高于其他3 种酶。这可能是由于蜗牛酶含有纤维素酶、β-D-葡糖糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多种酶，其中的一些酶对葡萄糖苷键具有较强的水解作用。相比单一酶来说，蜗牛酶这种复合酶对于葡萄糖苷键的水解更有优势。因此，在后续实验中选择了蜗牛酶。

图2 不同浓度水解酶对柴胡皂苷B1 转化率的影响

3.2.2 酶／底物质量比 如图3A 所示，当质量比由4 ∶1提高到30 ∶1 时，转化率从94%增加至99%，继续提高质量比，则转化率变化不明显。因此，最佳酶／底物质量比为30 ∶1。

图3 单因素对柴胡皂苷B1 转化率的影响

3.2.3 缓冲液pH 如图3B 所示，在pH3.0～4.5 范围内，随着缓冲液pH 升高，转化率逐渐升高，并在pH4.5 时达到最高值99.5%，但是将pH 进一步提高至5.5 后，转化率明显下降，当pH 为6.5 时，转化率仅为81.2%。因此，最佳缓冲液pH 值为4.5。

3.2.4 反应温度 如图3C 所示，蜗牛酶对柴胡皂苷B1的转化效果随着温度的升高呈现先增加后减弱的趋势，并在60 ℃时达到最大值； 当温度继续升高时，酶蛋白开始变性失活，导致转化率下降。因此，最佳反应温度为60 ℃。

3.2.5 反应时间 如图3D 所示，柴胡皂苷B1被蜗牛酶水解12 h 之后，转化率可达95%，延长水解时间至24 h，转化率可进一步提高到99%； 此后，转化率保持平稳。综合考虑柴胡皂苷B1转化率和节约时间，选择24 h 作为最佳酶水解时间。

3.3 响应面试验结果

3.3.1 回归方程及显著性分析 通过Box-Behnken 响应面实验设计考察了缓冲液pH （X1）、反应温度（X2）和反应时间（X3）对柴胡皂苷B1转化率的影响，实验结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果

将以上所得数据进行多元回归分析，得到拟合方程Y＝97.76 ＋0.36X1- 2.20X2＋1.12X3＋5.51X1X2- 0.17X1X3＋0.90X2X3-3.37X21- 3.75X22＋2.20X23。此外，以转化率为响应值对各因素的显著性进行分析（表3），P＜0.000 1 且失拟项不显著，可见所得模型能准确分析和解释模型中各因素对响应值的影响； 同时，反应温度的升高不利于转化率的增加，而较长的反应时间和较高的缓冲液pH 则有利于提升柴胡皂苷B1转化率。从二次项的P值分析可知，X12（P＝0.0002）、X22（P＜0.0001）、X32（P＝0.0020）均小于0.05，三者对柴胡皂苷B1的转化率具有显著性影响。

表3 二阶多项回归方程方差分析

3.3.2 反应时间和缓冲液pH 对柴胡皂苷B1转化率的影响 反应时间和缓冲液pH 的交互作用见图4。当体系中pH为4.5 时，随着反应时间的增加，柴胡皂苷B1转化率缓慢上升后趋于稳定； 当反应时间为24 h 时，转化率随着pH值的增加呈现先增加后降低的趋势，pH 偏高或偏低时会影响蜗牛酶与底物的结合，降低反应速率。

图4 交互项（反应时间和缓冲液pH）对柴胡皂苷B1转化率的影响

3.3.3 反应温度和缓冲液pH 对柴胡皂苷B1转化率的影响 反应温度和缓冲液pH 的交互作用见图5。当反应温度为60 ℃时，随着体系中pH 升高，柴胡皂苷B1转化率先上升后下降； 当pH 4.5 时，转化率随着温度的升高呈现出相同的趋势，即先增加后降低，表明反应温度和缓冲液pH 过高或过低均不利于酶水解反应的进行。

图5 交互项（反应温度和缓冲液pH）对柴胡皂苷B1转化率的影响

3.3.4 反应温度和反应时间对柴胡皂苷B1转化率的影响 反应温度和反应时间的交互作用见图6。当反应温度为60 ℃时，随着反应时间的增加，柴胡皂苷B1转化率先上升后趋于稳定； 当反应时间为24 h 时，转化率随着温度的升高先增加后迅速降低。

3.3.5 最佳水解条件及验证试验 通过Design-expert 8.0.6.1 软件优化后得到蜗牛酶水解柴胡皂苷B1的最佳反应条件为反应温度55.78 ℃，反应时间33.24 h，缓冲液pH

图6 交互项（反应温度和反应时间）对柴胡皂苷B1转化率的影响4.36，并对其进行验证，考虑到实验的实际可操作性，将水解条件调整为反应温度56 ℃，反应时间33 h，缓冲液pH 4.5； 在此条件下，3 次平行实验所得的柴胡皂苷B1转化率为99.1%，与预测值100.2%基本相符，表明优化得到的酶水解条件与实际拟合度较好。

3.4 酶解产物的结构鉴定 ESI-MSm／z：641［M＋Na］＋。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ：0.58 （s，24-CH3），0.66 （s，26-CH3），0.73 （s，29-CH3），0.84（s，25-CH3），0.90 （s，30-CH3），0.93 （s，27-CH3），1.22 （d，H-6′），4.33 （d，H-1′），5.55 （dd，H-11），6.35 （dd，H-12）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ：38.0（C-1，19），25.5 （C-2），80.3 （C-3），43.0 （C-4），46.6（C-5），18.7 （C-6），32.0 （C-7），40.4 （C-8），54.0 （C-9），36.1 （C-10），126.8 （C-11），125.4 （C-12），135.7（C-13），43.8 （C-14），34.2 （C-15），75.4 （C-16），43.7（C-17），133.2 （C-18），32.6 （C-20），34.8 （C-21），29.7 （C-22），63.1 （C-23），12.9 （C-24），17.7 （C-25），17.2 （C-26），21.9 （C-27），62.8 （C-28），24.9 （C-29），32.4 （C-30），105.2 （3-O-Fuc-C-1′），74.1 （C-3′），71.6（C-2′），71.4 （C-4′），70.2 （C-5′），17.0 （C-6′）。以上数据与文献［17-18］报道基本一致，故鉴定该化合物为前柴胡皂苷A。

4 结论与讨论

本研究基于酶水解构建了从柴胡皂苷B1制备稀有前柴胡皂苷A 的关键技术。与传统酸水解相比，该方法可方便地获取柴胡次级苷，而不产生柴胡皂苷元副产物； 而且在反应过程中不使用无机酸，因此是一种清洁的水解技术。本文所建立的酶水解关键技术，可为大量制备前柴胡皂苷A 以开展药理药效研究奠定基础。

采用单因素和响应面相结合的方法对酶水解条件进行优化，并利用LC-MS、NMR 确定产物的化学结构。结果表明，柴胡皂苷B1的最佳水解酶为蜗牛酶，当酶／底物质量比为30 ∶1、酶解反应时间33 h、酶解反应温度56 ℃、缓冲液pH 4.5 时，柴胡皂苷B1转化率高达99.1%，产物为前柴胡皂苷A。

中药活性成分包括三萜类、黄酮类、蒽醌类、甾体类、生物碱类等，是中医药在临床实践中发挥防病治病作用的重要物质基础，同时也是现代医药产业中备受关注的药用分子实体，其新型制备技术是近年来较为活跃的研究领域。本文所构建的酶水解法具有效率高和操作方便等优点，利用该技术从天然产物中获取生物活性化合物（包括次级苷或苷元）具有良好的发展潜力。