UPLC-MS／MS 法同时测定朱日亨滴丸中15 种成分

布 仁，张彭鹏，王跃武，祖 文，梁方圆，王小宁，陆景坤*

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010010； 2.包头中药有限责任公司，内蒙古 包头 014040；3.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010010）

蒙医治疗冠心病有悠久的历史，积累了丰富的经验，将本病归属于“心刺痛” 范畴［1］。朱日亨滴丸源自蒙医国医大师苏荣扎布教授治疗“赫依盛型心刺痛” 的多年临床验方［2］，由广枣、肉豆蔻、阿魏、红花、栀子、牛黄、沉香、草果、冰片9 味药材组成，具有清心热、化瘀血、补心功效，主治心热、心赫依、心刺痛、心慌气短［3-6］。课题组前期对朱日亨滴丸醇提物中7 种成分进行含量测定［7］，并对130 种成分进行鉴定和归属［8］。在此基础上，本实验建立超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（UPLC-MS／MS）法同时测定朱日亨滴丸中鞣花酸、没食子酸、去氢二异丁香酚、甲基丁香酚、榄香素、绿原酸、栀子苷、芦丁、羟基红花黄色素A、阿魏酸、沉香四醇、龙脑、胆酸、牛磺酸、去氧胆酸的含量，以期为该制剂质量控制和评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Thermo UltiMate 3000 高效液相色谱仪、Q-Exactive 串联质谱系统 （美国Thermo 公司）； TB-214 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）； 超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）； 离心浓缩装置，配置UT200 冷阱、CVE-3110 离心浓缩组合（东京理化器械株式会社）。

1.2 试剂 鞣花酸（批号111959-201903）、没食子酸（批号110831-201906）、去氢二异丁香酚（批号111838-201403）、甲基丁香酚（批号111642-200301）、绿原酸（批号110753-202018）、栀子苷（批号 110749-201919）、芦丁 （ 批号 100080-201610）、羟基红花黄色素 A （批号111637-201810）、阿魏酸（批号110773-201614）、沉香四醇（批号111980-201904）、胆酸（批号100078-201415）、牛磺酸（批号111616-201605）、去氧胆酸（批号110724-201808）、龙脑 （批号111688-200501）对照品均购自中国食品药品检定研究院；榄香素对照品（批号487-11-6）购自北京英莱克发展有限公司，纯度均≥98%。聚乙二醇、二甲基硅油均购自江西益普生药业有限公司； 吐温-80 购自湖南尔康制药股份有限公司。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯； 其他试剂均为分析纯。

1.3 药物与药材 朱日亨滴丸 （编号D22001、D22002、D22003）由内蒙古医科大学蒙药创新研究中心研制，包头中药有限责任公司生产。阿魏购自亳州抱朴药业有限公司，人工牛黄购自四川弘茂制药有限公司，冰片购自四川青神康华制药有限公司，其他7 味药材均购自内蒙古亿利甘草有限公司，经内蒙古医科大学薛培凤教授鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》 一部规定。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液 精密称取3 批样品，每批4 粒（约2.5 g），置于5 mL 量瓶中，加入4 mL 50%乙醇崩解后定容，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇定容至5 mL，制成贮备液，置于4 ℃冰箱中，取适量转移至量瓶中，流动相定容，即得。

2.2 UPLC-MS／MS 分析条件

2.2.1 色谱 Thermo C18色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）； 流动相乙腈（A）-0.1%甲酸（含10 mmol／L 乙酸铵）（B），梯度洗脱（0 ～20 min，10% ～90%A）； 体积流量0.3 mL／min； 柱温30 ℃；进样量3 μL。

2.2.2 质谱 电喷雾离子源（ESI）； MS dd-ms2扫描模式定性； 一级全扫模式定量； 正负离子扫描，负离子模式下鞘气体积流量12 L／min，辅助气体积流量5 L／min，喷雾电压2.8 kV，毛细管离子传输管温度350 ℃，S-lens 水平50，扫描范围m／z100～1 000，而正离子模式下喷雾电压3.5 kV，其余条件同负离子模式。采用各化合物准分子离子峰作为定量监测离子，二级碎片扫描后与相应对照品二级碎片进行比对，以期确保所测色谱峰为目标化合物，而非其同分异构体或同质异素体。其他质谱参数见表1，二级质谱图见图1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液适量，依次稀释100、30、20、10、3、2、1 倍，在“2.2” 项条件下进样测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1” 项下供试品溶液3 μL，在“2.2” 项条件下进样测定6次，测得鞣花酸、没食子酸、去氢二异丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、榄香素、绿原酸、栀子苷、芦丁、阿魏酸、羟基红花黄色素A、去氧胆酸、胆酸、牛磺酸、龙脑峰面积RSD 分别为3.67%、5.16%、3.40%、10.25%、3.18%、9.22%、4.74%、10.55%、2.11%、5.60%、1.99%、2.99%、2.30%、8.65%、4.33%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取本品适量，按“2.1.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，测得鞣花酸、没食子酸、去氢二异丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、榄香素、绿原酸、栀子苷、芦丁、阿魏酸、羟基红花黄色素A、去氧胆酸、胆酸、牛磺酸、龙脑含量RSD 分别为2.85%、3.00%、5.54%、8.41%、4.25%、4.72%、2.07%、8.16%、3.03%、4.23%、3.41%、6.84%、3.03%、6.23%、4.47%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.1.1” 项下供试品溶液适量，于0、1、2、4、8 h 在“2.2” 项条件下进样测定，测得鞣花酸、没食子酸、去氢二异丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、榄香素、绿原酸、栀子苷、芦丁、阿魏酸、羟基红花黄色素A、去氧胆酸、胆酸、牛磺酸、龙脑峰面积RSD 分别为5.47%、8.89%、3.36%、9.91%、3.98%、9.94%、3.99%、5.42%、1.25%、6.28%、3.18%、1.72%、1.34%、11.31%、2.89%，表明溶液在8 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取各成分含量已知的的本品（批号D22001）6 粒（约1.2 g），按100%水平加入对照品溶液，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，鞣花酸、没食子酸、去氢二异丁香酚、甲基丁香酚、沉香四醇、榄香素、绿原酸、栀子苷、芦丁、阿魏酸、羟基红花黄色素A、去氧胆酸、胆酸、牛磺酸、龙脑平均加样回收率（RSD）分别为105.59% （4.20%）、75.91% （5.31%）、111.81%（7.13%）、105.25% （10.02%）、95.86% （9.40%）、84.36% （4.49%）、107.37% （11.17%）、87.42%（3.19%）、109.14% （3.09%）、90.58% （5.92%）、95.51% （3.33%）、103.39% （10.66%）、95.66%（3.03%）、112.13% （9.83%）、106.06% （3.81%）。

2.4 样品含量测定 取3 批样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （n＝3）

3 讨论

研究表明，没食子酸、鞣花酸是朱日亨滴丸君药广枣特征成分，去氢二异丁香酚、榄香素、甲基丁香酚是臣药肉豆蔻特征成分，沉香四醇、阿魏酸、羟基红花黄色素A、栀子苷、龙脑分别是沉香、阿魏、红花、栀子、冰片2020 年版《中国药典》 检测成分，去氧胆酸、牛磺酸、胆酸是人工牛黄主要成分，芦丁是广枣、红花共有成分，绿原酸是红花、栀子共有成分，没食子酸是广枣、红花共有成分，其中没食子酸具有较强的抗氧化、抗炎活性［9］，绿原酸、芦丁均具有糖脂代谢调控活性［10-11］，去氢二异丁香酚、栀子苷具有显著的抗炎活性［12-14］，阿魏酸［15-16］、牛磺酸［17］能抑制血小板凝集，羟基红花黄A 具有保护心血管活性［18］，鞣花酸具有抗炎、抗氧化活性［19］。课题组前期研究也发现，鞣花酸、甲基丁香酚均可直接或间接调节PI3K-Akt 信号通路，从而减少H9c2 心肌细胞氧化损伤［20］。

本实验分别对不同流动相［甲醇-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 甲酸（含10 mmol／L乙酸铵）］、稀释液（水、30% 甲醇、50% 甲醇、70%甲醇、甲醇）进行考察，发现50% 甲醇稀释后乙腈-0.1%甲酸洗脱时各成分色谱峰峰形、响应最优。另外，方法学考察结果显示，各成分线性关系良好，精密度、重复性、加样回收率RSD 均符合要求，加样回收率在3.03% ～11.17% 之间，供试品溶液在8 h 内稳定性良好。

2020 年版《中国药典》 规定了广枣、肉豆蔻、沉香、红花、栀子、人工牛黄、人工冰片中特征成分限量标准，以及草果、阿魏中挥发油含量。为了改善全产业链质量控制，本实验在此基础上又增加了8 种质控成分，初步表明朱日亨滴丸中原药材所含有效成分均得到了很好的物质传递。