乙醇-硫酸铵双水相体系萃取香椿籽总黄酮工艺优化及其抗氧化活性研究

高慧娟，张佳奇，张乐乐，刘生杰，*

（1.阜阳师范大学生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037； 2.阜阳师范大学信息工程学院食品系，安徽 阜阳 236041）

香椿籽为楝科植物香椿Toonasinensis（A.Juss.）Roem.的种子，含有黄酮、多酚、萜类、多糖、挥发油等多种成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生物活性［1］，其中黄酮是其发挥抗氧化、抗炎、抗病毒作用的主要物质［2］，该类化合物常用提取方法主要包括有机溶剂提取、超声提取、酶解、CO2超临界提取［3］，乙醇回流、超声提取［4］、酶解协同超声提取［5］等。双水相技术根据物质在两相中溶解度的不同而使目标物得到萃取和分离，具有提取率高、易于放大生产、可连续操作的特点，广泛应用于生物活性物质［6］，其中乙醇／盐双水相系统因其黏度低、成本低，常用来提取纯化黄酮类成分［7］。目前，双水相法已应用于桃花、绞股蓝、青果、沙葱中黄酮类成分的提取，取得较好效果［8-12］，但迄今尚未涉及香椿籽总黄酮，故本实验优化该成分乙醇-硫酸铵双水相体系萃取工艺，并考察其抗氧化活性，以期为其开发利用提供参考。

1 材料

香椿籽产自陕西安康秦巴山区，经专家鉴定为正品。芦丁对照品及分析纯亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸铵均购于西陇科学股份有限公司。维生素C 购于上海展云化工有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，2-联氮基-双- （3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司； 过硫酸钾购于上海沃凯生物技术有限公司。羟自由基试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

2 方法与结果

2.1 样品处理 香椿籽在60 ℃下烘干至恒重，粉碎后过60 目筛，经石油醚脱脂、烘干、分装后置于干燥器中保存。

2.2 方法学考察 称取20.0 mg 芦丁对照品，80%乙醇溶解定容至50 mL，作为对照品溶液，参考文献［13］报道进行线性关系考察，得方程为Y＝6.11X-0.006 2 （R2＝0.999 6），在0 ～0.2 mg／mL范围内线性关系良好。另外，精密度RSD 为6.47%，重复性RSD 为4.40%，30 min 内稳定性RSD 为1.26%，均满足分析要求。

2.3 总黄酮提取 将一定量无水乙醇、硫酸铵用超纯水溶解混匀，构建10 mL 双水相体系，加入适量脱脂香椿籽粉末，超声处理后3 500 r／min 离心10 min，测定上下相体积、吸光度，计算总黄酮萃取率，公式为萃取率＝ ｛1／ ［1 ＋1／ （R×K）］｝ ×100%，其中R＝V上相体积／V下相体积，K＝上相黄酮含量／下相黄酮含量，提取液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，置于干燥器中密封保存。

2.4 单因素试验 固定硫酸铵用量2.2 g，香椿籽用量0.2 g，300 W 超声处理30 min，以无水乙醇体积（3.0、3.2、3.5、3.8、4.0 mL）、硫酸铵用量（1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 g）、香椿籽用量（0.10、0.15、0.2、0.25、0.30 g）、超声时间（10、20、30、40、50 min）为影响因素，按“2.3” 项下方法提取总黄酮并计算其萃取率，平行3 次。

2.4.1 乙醇体积 图1 显示，随着乙醇体积增加总黄酮萃取率逐渐升高，为3.5 mL 时最高，之后反而降低。

图1 乙醇体积对总黄酮萃取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume on extraction rate of total flavonoids

2.4.2 硫酸铵用量 图2 显示，随着硫酸铵用量增加总黄酮萃取率先升后降，为2.2 g 时最高。

图2 硫酸铵用量对总黄酮萃取率的影响Fig.2 Effect of ammonium sulfate consumption on extraction rate of total flavonoids

2.4.3 香椿籽用量 图3 显示，随着香椿籽用量增加总黄酮萃取率先升后降，为0.2 g 时最高。

图3 香椿籽用量对总黄酮萃取率的影响Fig.3 Effect of T.sinensis seeds consumption on extraction rate of total flavonoids

2.4.4 超声时间 图4 显示，随着超声时间延长总黄酮萃取率先升后降，为30 min 时最高。

图4 超声时间对总黄酮萃取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total flavonoids

2.5 响应面法 在单因素试验基础上，选择乙醇体积（A）、硫酸铵用量（B）、香椿籽用量（C）、超声时间 （D）作为影响因素，总黄酮萃取率（Y）作为评价指标，采用Design-Expert 10.0 软件设计四因素三水平实验，因素水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

采用Design-Exper 10.0 软件对表2 数据进行拟合，得方程为Y＝93.312＋1.15A-0.04B＋0.422 5C-0.709 17D- 0.952 5AB- 0.125AC- 1.012 5AD＋0.555BC＋0.357 5BD＋0.127 5CD- 1.803 5A2-2.981B2-2.027 25C2-3.822 25D2，方差分析见表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明方程拟合度较好，可用于分析预测； 各因素影响程度依次为乙醇体积＞超声时间＞香椿籽用量＞硫酸铵用量。响应面分析［14］见图5。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

图5 各因素响应面图Fig.5 Response surface plots for various factors

2.6 验证试验 根据“2.5” 项下结果，确定最优工艺为乙醇体积3.612 1 mL，硫酸铵用量2.187 g，香椿籽用量0.204 g，超声时间28.559 min，总黄酮萃取率为93.596%，考虑到实际情况，将其修正为乙醇体积3.6 mL，硫酸铵用量2.2 g，香椿籽用量0.2 g，超声时间29 min，总黄酮萃取率为93.430%，与预测值93.596% 接近，表明该工艺稳定可靠。

2.7 抗氧化活性研究 准确称取香椿籽粉末0.005、0.01、0.02、0.04、0.05 g，80%乙醇制成1、2、4、8、10 mg／mL 待测液，再配制不同质量浓度维生素C 溶液代替待测液作为阳性对照，检测其对DPPH 自由基、羟自由基、ABTS 自由基的清除能力，结果见图6。由此可知，维生素C 在较低质量浓度下对上述3 种自由基的清除能力随着其剂量增加而升高，为0.5 mg／mL 时最强，最大清除率分别为96.83%、99.80%、86.73%。

图6 维生素C 对不同自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacities of vitamin C on different free radicals

2.7.1 DPPH 自由基 参照文献［13］报道，并稍作修改。向100 μL 不同稀释度的待测液中加入100 μL 以80% 乙醇配制的0.1 mmol／L DPPH 溶液，室温避光反应30 min，在517 nm 波长处测定吸光度A，再以等体积80%乙醇代替DPPH 溶液作为对照组，等体积80%乙醇代替样品溶液作为空白组同法测定，平行3 次，计算自由基清除率，公式为清除率＝ ［1- （A样品-A对照）／A空白］×100%。

2.7.2 羟自由基 按照羟自由基试剂盒方法进行测定，反应结束后在550 nm 波长处测定吸光度A，计算自由基清除率，公式为清除率＝ ［（A对照-A测定）／ （A标准-A空白）］×100%。

2.7.3 ABTS 自由基 参照文献［13］报道，并稍作修改。分别配制7.4 mmol／L ABTS、2.6 mmol／L 过硫酸钾贮备液，制备ABTS 工作液。吸取100 μL 不同稀释度的待测液，与900 μL ABTS工作液充分混合10 s，避光反应6 min，在734 nm波长处测定吸光度A，再以80%乙醇代替待测液作为空白组同法测定，平行3 次，计算自由基清除率，公式为清除率＝ ［（A空白-A样品）／A空白］×100%。

2.7.4 结果分析 图7 显示，总黄酮质量浓度为1～4 mg／mL 时对DPPH 自由基的清除能力有较明显的剂量依赖性，为4 mg／mL 时最大（清除率93.68%），是维生素C 的96.75%，超过4 mg／mL后趋于平缓； 总黄酮质量浓度为1 ～2 mg／mL 时可大大提高对羟自由基的清除能力，高于2 mg／mL时程度减小，为 8 mg／mL 时最大 （清除率85.61%），是维生素C 的85.78%，但继续增加时反而下降； 随着总黄酮质量浓度增加对ABTS 自由基的清除能力逐渐加强，超过4 mg／mL 后程度趋缓，为10 mg／mL 时最大（清除率82.26%），是维生素C 的94.85%。

图7 香椿籽总黄酮对不同自由基的清除能力Fig.7 Scavenging capacities of total flavonoids from T.sinensis seeds on different free radicals

3 讨论

双水相中醇类与黄酮分子有更强的氢键相互作用［7］，使乙醇相能更好地溶解黄酮，在一定范围内增加乙醇体积分数时可提高分相能力，使上相极性变低，有利于总黄酮提取，但其过高时上相极性过低，该成分溶出减少，反而不利于提取［9-10，12，15］。当双水相中乙醇添加量固定时，增加硫酸铵会竞争性结合更多水分子，本实验发现，硫酸铵用量超过2.2 g 时乙醇相体积减少，导致乙醇体积分数过高，即上述双重作用降低了总黄酮萃取率［6，8］。

长时间超声既可能引起样品中其他物质溶出，从而影响黄酮在上下相的溶出［16］，又会导致黄酮被氧化分解，不利于其提取［15，17-18］。双水相体系中上、下相体积在固定的情况下总黄酮饱和能力基本稳定，其中上相由于对该成分有较强的溶出能力，更容易达到饱和； 下相远没达到饱和，会增加香椿籽添加量，使得该成分会继续在下相溶出，从而改变其在上、下相的分配比例，导致上相萃取率有所下降，与肖连冬、池汝安等［17，19］报道一致。

黄酮类物质含有酚羟基，能以供氢体还原自由基，从而发挥抗氧化作用，减少自由基对机体细胞的毒性作用，并可通过减少体内氧化应激损伤来避免疾病发生、减缓衰老［20］。抗氧化活性实验发现，香椿籽总黄酮对DPPH、ABTS、羟自由基均表现出较强的清除能力，与赵二劳、李光辉等［21-22］报道一致，程度依次为DPPH 自由基＞羟自由基＞ABTS 自由基，表明该成分可作为天然抗氧化剂开发利用，但其作用机制及在动物体内的抗氧化活性还有待深入研究。