大鼠脑隐球菌感染模型建立及MRI评估

李锦 努尔比耶姆·阿布力克木 王刚 李嫣然 刘露露 姜春晖 王晓东 姜涛 和清源 王云玲 王俭

(1.新疆医科大学第一附属医院影像科,乌鲁木齐 830011;2.北京大学第三医院放射科 磁共振设备与技术北京市重点实验室,北京 100191)

隐球菌属中的新生隐球菌和哥特隐球菌是主要致病菌,具有嗜中枢性,每年导致全球100万例患者感染和60万例免疫抑制患者(艾滋病、移植受者)因机会性侵袭性感染而死亡[1]。 脑隐球菌感染一般表现为脑膜脑炎,14%～25%的患者可发生脑实质隐球菌肉芽肿[2-3],其隐匿的临床表现和缓慢发作的症状[4],易造成漏诊误诊。目前动物模型可复制临床上不常见的疾病,避免人体实验造成的伤害,同时获得人类临床研究难以获取的资料。MRI可以提供动物模型与人类疾病相似图像结果。因此建立有效的脑隐球菌感染模型,探讨MRI影像学表现,可为脑隐球菌研究提供与人体接近的实验模型及评估方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

新疆医科大学动物实验中心提供清洁级SD(Sprgue-Dawley)大鼠30只,对大鼠进行编号及体质量测量,均为雌性,4～5月龄,体重250 g左右,于自由进食水的鼠笼内喂养。

新疆医科大学第一附属医院伦理委员会论证、批准实施(审批号:20190225-100)。

1.2 隐球菌菌株培养稀释与制备

新疆医科大学第一附属医院皮肤科复苏传代成功的A型新生隐菌转种于YPD(yeast extract peptone dextrose medium)培养基中,将传代成功的菌苔稀释于10 mL生理盐水,使用微量移液器取1 μL混悬液置于细胞计数板表面,按技术规程进行计数,至少计数两次,取其平均值,配置成浓度为1×106CFU/mL混悬液备用。

1.3 动物模型建立

大鼠麻醉(肌注舒泰10 mg/kg +盐酸赛拉嗪10 mg/kg)成功后,立体定位仪固定鼠脑,按《大鼠脑立体定位图谱》[5]定位标记尾状核(前囟:前1 mm,右/左3.5 mm)作为针刺点。术区备皮,剃去头顶毛发暴露囟门,1%浓度碘伏消毒,切开并分离皮下组织及骨外膜;颅骨钻颅骨钻孔,骨穿刺针垂直穿刺,有落空感时拔出针芯;10 μL微量进样器吸取10 μL稀释备用的菌悬液,缓慢垂直进针约4 mm,以1 μL/min匀速注射入尾状核,注射完毕后停针8 min,缓慢旋转拔针2 min,拔针纱布按压,颅骨钻孔处骨蜡封闭,外科线缝合,留观至麻醉苏醒。

1.4 MRI检测与MRI图像判读

大鼠分别于造模后14 d、21 d、28 d行MRI扫描监测接种情况。大鼠麻醉平稳后,使用德国西门子Skyra 3.0TMRI成像设备、8通道相控矩阵腕关节线圈进行头颅扫描,大鼠取俯卧位置头于线圈中心固定,保持呼吸道通畅,扫描序列包括T1WI、T2WI序列。

扫描参数如下:T1WI(T1加权像):TE(回波时间)=3.7 ms,TR(重复时间)=1500 ms,FA(翻转角)=9°,TI(翻转时间)=900 ms,层厚=1 mm,FOV(扫描野)=267 mm,体素=0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm;T2WI(T2加权像):TE=92 ms,TR=3620 ms,FA=120°,层厚=2 mm,FOV=80 mm,分辨率=256×256。采集图像后,由两名影像科医生进行分析、判读,讨论影像学表现,确定模型结果。

1.5 病理标本采集与研究

MRI扫描图像采集完以颈椎脱位法处死大鼠,将所有死亡的大鼠脑与颅骨分离,观察大脑形态, 切开测量肿瘤大小, 行病理切片制作与HE染色,将制好的病理切片置于电子显微镜下,由两名动物实验中心病理医生阅读切片,分析、确定结论。

2 结 果

2.1 MRI表现

隐球菌肉芽肿形成MRI表现:尾状核可见类圆形或结节样异常信号影,T1WI低信号、T2WI高信号。隐球菌性脑膜脑炎MRI表现:尾状核脑膜、室管膜明显线样异常信号改变,伴侧脑室不同程度水肿。无异常组:脑实质及脑膜未见明显异常信号。

2.2 建模成功率与动物生存

第14天建模成功率43.33%:30只SD大鼠脑感染隐球菌模型中1只于造模后第2天死亡;9只(30%)形成隐球菌肉芽肿;4只(13.33%)隐球菌性脑膜脑炎;16只(53.33%)未见明显异常;其中1只大鼠于14 d常规MRI扫描后死亡,MRI未见明显异常。

第21天建模成功率60%:28只脑隐球菌感染模型鼠中14只(46.67%)表现为隐球菌肉芽肿形成,7只与第14天MRI表现无差别,3只由脑膜脑炎演变,4只由无异常演变;4只(13.33%)隐球菌性脑膜脑炎,1只与14 d MRI表现无差别,3只由无异常演变;10只(33.33%)未见明显异常。2只由肉芽肿演变。

第28天建模成功率73.33%:28只脑隐球菌感染模型鼠中18只(60%)表现为隐球菌肉芽肿形成,14只与21 d MRI表现无差别,4只由无异常演变;4只(13.33%)隐球菌性脑膜脑炎;6只(20%)未见明显异常。

2.3 病理结果(HE染色)

隐球菌肉芽肿病灶肉眼观鼠脑尾状核区、部分脑表面可见黄色浓稠渗出液和坏死灶,镜下观可见由淋巴细胞及多核巨细胞构成的肉芽肿灶,内见大量类圆形蓝染真菌孢子聚集(见图1)。

图1 SD大鼠脑感染隐球菌肉芽肿镜下病理图像,HE染色10×10倍镜下(A)见脑实质多发囊腔,脑实质炎性细胞浸润;HE染色40×10倍镜下(B)见脑实质散在大量类圆形蓝染真菌孢子Fig.1 Microscopic pathological observations of cryptococcal granu-loma of the brain, under 10×10 fold microscope (A) with HE staining, multiple cysts and inflammatory cell infil-tration in brain parenchyma were seen; under the 40×10 fold microscope (B) with HE staining, a large number of round-like blue-stained fungal spores were scattered in the brain parenchyma

脑膜脑炎病灶肉眼观鼠脑尾状核区局部充血水肿,镜下观可见脑膜和/或脑室管膜多发类圆形蓝染真菌孢子。

无异常组肉眼观鼠脑组织大体未见明显异常,镜下观未见真菌孢子浸润。

3 讨 论

隐球菌是一种具有多糖的孢子囊的酵母菌,是影响神经系统的最普遍的真菌[6],可以感染免疫低下和免疫正常的个体,在免疫功能低下的患者中更常见,如细胞介导免疫功能受损的患者、血液系统恶性肿瘤患者、实体器官移植受者以及接受长期皮质类固醇或其他免疫抑制治疗的患者[7]。脑隐球菌感染临床表现无特异性,隐球菌性脑膜脑炎患者通常在2～4周内出现头痛、嗜睡、发烧等亚急性症状, 仅1/4的患者出现典型的颈部僵硬等脑膜脑炎症状[8],免疫功能低下患者隐球菌感染易与其他疾病重叠,导致延迟诊断增加神经系统后遗症的风险[9],致使隐球菌引起的脑损伤难以正确诊断和有效治疗,因此快速鉴别诊断和早期治疗对于获得良好结果至关重要[10]。

建立动物模型是研究隐球菌的方法之一,根据研究需求,选择合适的动物模型及建模方式是研究的关键。研究表明小鼠对隐球菌天然易感,但小鼠体型小,血、脑脊液含量少,无法进行一些精细操作;家兔隐球菌性脑膜脑炎模型则需使用免疫抑制剂[11]。大鼠与人类的生理具有很高的相似性,容易外科操作处理,表现出较少的应激反应。此次实验大鼠建模后存活率93.33%,死亡率仅6.67%,提示存活率高、可行性强,大鼠可以作为脑隐球菌感染的建模对象。接种方式的选择,既往研究隐球菌大鼠模型气管接种主要用于建立隐球菌肺炎模型[12],很难建立颅内感染模型;静脉注射和腹腔注射可以感染脑或肺,但感染的程度可能不同,无法控制实验变量的统一[11],所以选择直接颅内注射,不仅感染方式直接,减少干扰因素,而且此方式易致病并易动态观察感染状态。研究结果显示大鼠隐球菌感染模型成功率为73.33%,形成脑隐球菌肉芽肿60%,形成脑膜炎13.33%,表明直接颅内注射可得到较高的致病率和较高的致病性,可以建立较好的隐球菌感染动物实验模型。

MRI是一种多功能且无创的成像方式,具有出色的穿透深度、组织覆盖率和软组织对比度[13],且人们越来越重视对使用大鼠模型在脑部疾病与药物干预的纵向研究中MRI的应用[14]。相关研究报道,在隐球菌性脑膜脑炎发生前2个月时, CT常规扫描可无异常发现,但MRI优于CT,可为临床的早期诊断和处理提供依据[15]。此次实验以第28天MRI影像表现为最后结果,4只(13.33%)大鼠形成隐球菌脑膜脑炎,隐球菌穿透脑膜血管壁,迁移到 Virchow-Robin(血管周围)[16]间隙,随后随着炎症细胞的激活和黏液物质的沉积而扩张形成胶状假囊[17]在MRI表现为尾状核脑膜、室管膜线样异常信号改变,伴侧脑室不同程度水肿。18只(60%)大鼠形成脑隐球菌肉芽肿形成,大量生物体和凝胶状物质[18]增殖形成肉芽肿[19]。凝胶状物质在T1WI显示低信号,T2WI 成像显示围绕高信号中心的低信号环。此次实验大鼠脑隐球菌肉芽肿在MRI上表现为尾状核类圆形或结节样异常信号影,T1WI低信号T2WI高信号。本实验利用MRI对大鼠隐球菌的建模进行评估,探讨每一只大鼠在造模初期、中期、晚期影像学表现,与病理结果比较,结果高度一致,核磁判断感染准确率高,表明MRI是评估隐球菌感染的有效方法。

本实验的不足之处在于仅扫描了MRI常规序列,对隐球菌性脑膜脑炎感染的影像学表现探讨欠佳;但是成功建立了大鼠颅内隐球菌感染模型,并且能够确保建模后大鼠的存活率及建模成功率,MRI可以清楚的显示大鼠脑内病变,一定程度上反映病理学特征。综上所述,大鼠颅内隐球菌感染模型可为未来中枢神经隐球菌感染研究提供与人体接近的实验模型,MRI在评估脑隐球菌感染方面有良好的价值。

致谢:感谢海军军医大学第二附属医院(上海长征医院)皮肤科,上海市医学真菌分子生物学重点实验室陈敏老师对新生隐球菌培养及传代技术的支持。