甲真菌病的最新诊疗进展

黄欣 严秋红 袁小英

(空军特色医学中心皮肤科,北京 100142)

甲真菌病(onychomycosis)是指由皮肤癣菌、酵母菌和非皮肤癣菌性霉菌(non-dermatophyte moulds,NDMs)侵犯甲板和/或甲床所致的疾病,皮肤癣菌引起的甲真菌病通常称为甲癣[1],最常见的皮肤癣菌是红色毛癣菌。甲真菌病具有传染性,影响患者生活质量,易与其他甲病混淆,如果不及时治疗,还可能诱发其他疾病,故准确诊断该病尤为重要。常规检查方法包括真菌镜检、真菌培养和组织病理检查,但均存在一定局限性,比如:真菌镜检缺乏敏感性,且不能确定致病真菌的种类;真菌培养得到结果耗时较长,且假阴性率较高;组织病理不能确定菌种和生存能力。近年来出现了一些新的诊断技术,也许今后会逐步运用到临床检查中。此外,甲真菌病治疗周期长、复发率高,其治疗仍然存在挑战[1],近年也发展了不少新的治疗手段,故本文对甲真菌病的诊疗进展作如下综述。

1 诊断

1.1 聚合酶链式反应(PCR)技术和高通量测序(NGS)技术

PCR是一种可以将DNA(deoxyribonucleic acid)片段放大几个数量级的分子生物学技术[2],在诊断甲真菌病方面具有较高的敏感性和特异性[3]。PCR主观性小,假阴性率较低,缺点是操作繁琐,价格相对昂贵,不能成为临床日常检测手段。而作为传统PCR替代方法的实时PCR(real time PCR,RT-PCR)可用于识别致病菌种,并提供真菌生存能力的信息[4]。此外,一项研究开发了一种基于松散分子信标(sloppy molecular beacon,SMB)探针的泛皮肤癣菌PCR技术,SMB与正常的信号分子相比,拥有相对较长的探针序列(长达40个核苷酸),使它们能够与许多不同物种的扩增子形成杂交。此研究收集了306份临床标本,分为三组,分别进行了直接镜检、真菌培养和PCR检测,结果表明这种新PCR技术能够检测和鉴定至少19种皮肤癣菌,敏感性和特异性分别为96.9%和90.4%,相较于真菌培养,也明显缩短了结果获取时间,由此可见新的PCR技术在检测皮肤癣菌方面表现优异,但此研究尚未观察到在检测非皮肤癣菌方面的优异表现[5]。真菌DNA不仅可从真菌培养物中提取,还可直接从采集的甲屑样本中提取,1 d内即可确定感染原,大大缩短了结果获取时间[6]。

高通量测序技术区别于传统Sanger(双脱氧法)测序,能够一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing,NGS),同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。国外一项研究收集了8816个趾甲样本,使用NGS成功地鉴定和量化皮肤癣菌、非皮肤癣菌性霉菌和细菌[7]。

1.2 质谱

基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption or ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)可用于对培养出的致病真菌进行鉴定[1]。这是一种电离化学物质,并根据其质荷比对离子进行分类的技术。MALDI-TOF MS生成的光谱可以通过使用参考数据库被快速识别。这项技术曾用于细菌鉴定,最近已应用于酵母和霉菌的鉴定[2]。从纯培养开始,MALDI-TOF MS 分析使用非常简单的样品制备程序,在几分钟内即可完成一次分析。耗材成本和制备时间远低于PCR分析[8]。但质谱仪本身费用较高,常规医院的皮肤真菌检测室配备此设备并不多见。

1.3 傅里叶变换衰减全反射红外光谱法

傅里叶变换衰减全反射红外光谱法(attenuated total reflection fourier transform infrared,ATR-FTIR)是一种可以提供生物样品化学成分完整信息的非破坏性、特异性技术。一项研究的预测模型对未感染甲和感染甲的分类准确率为96.9%。感染甲中,皮肤癣菌、NDMs和酵母菌属的总分类正确率分别为91.0%、97.7%和98.6%。体内感染和未感染甲的光谱也显示出明显的差异。因为该技术不需要任何试剂或大量的样品处理,可显著减少诊断和治疗的延误。该技术快速、简单、无损、便于携带,仅需最低水平的专业知识和相对较低的安装成本,但应用此项技术需要一个大型的参考光谱数据库,数据库中应包括甲基质的大部分变异和致病微生物的表型异质性[9]。

1.4 皮肤癣菌测试条

皮肤癣菌测试条(dermatophytes test strip,DTS)通过免疫层析法显示真菌抗原,提取液能提取出皮肤癣病菌细胞壁中的多糖,试纸条上的单克隆抗体与样本中的多糖能发生特异性反应[10]。先用指甲刀将甲样本切成小块,然后将这些小块添加到0.25 mL提取溶液中,混匀、研磨,静置1 min后放入测试条[10],如果在5～30 min后测试条上出现暗紫色线,则为阳性,如果在此时间限制内未见,则为阴性。一项研究显示DTS的敏感性为98%,特异性为78%,阳性预测值为84.8%,阴性预测值为97%[11]。一项多中心临床研究显示,在217个样本中,DTS和最终测定结果一致的样本数为211个,符合率为97.2%,表明DTS具有良好的检测能力,且检测时间仅需要15 min[12]。一项前瞻性研究显示,DTS比镜检有更高的特异性,此外,DTS与PCR 之间的结果一致率优于镜检与PCR之间的[13]。因此DTS为甲真菌病的检测提供了一种可靠、方便、快速的方法[10]。

1.5 Sub6检测技术

一项关于甲侵袭机制的研究表明,在体外生长条件下从未检测到的类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease 6,Sub6)是红色毛癣菌和趾间毛癣菌在感染期间分泌的主要蛋白酶[12]。Sub6是一种甲真菌病的强力标志物,有研究团队开发出了针对毛癣菌的Sub6单克隆抗体[14],用于检测感染甲中的皮肤癣菌。它们可以检测到与全长枯草杆菌蛋白酶相对应的40kDa条带和与酶主要降解产物相对应的20kDa条带,这些抗体通过western blotting或者ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)结合感染甲的蛋白提取物用于检测感染甲中的皮肤癣菌,其检测速度快,特异性高[12],可用于与甲创伤等其他疾病的鉴别。

1.6 皮肤镜及人工智能

皮肤镜是一种非侵入性诊断工具,可观察到异常指甲的微观特征。甲真菌病典型的皮肤镜表现包括:大理石样混浊区、甲下角蛋白及碎屑沉积、甲周皮肤干燥脱屑。特征性模式有:短刺状模式、纵向条纹模式、线状边缘模式、远端不规则中断模式[15]。皮肤镜检查快速、无创且价格低廉,但依靠肉眼进行诊断,主观性大,皮肤镜图像智能辅助诊断系统,即人工智能,正是解决这个问题的有效途径。在人工智能培训中,开发一个大型的图片数据库来捕捉各种各样的疾病表现是至关重要的。用人工智能检测甲真菌病具有巨大潜力,因为它是一种常见疾病,种族差异极小。2018年,Han等[16]开发了诊断甲真菌病的人工智能,使用基于区域的卷积神经网络(region-based convolutional neural networks,R-CNN)创建标准化的甲图像数据集,经训练后用于区分背景和甲改变,结果显示该系统的诊断准确率优于参与此研究的大多数皮肤科医生。

甲真菌病诊断方法总结见表1。

表1 甲真菌病诊断方法总结Tab.1 Diagnostic techniques for onychomycosis

2 治 疗

2.1 口服药物治疗

特比萘芬 特比萘芬是一种烯丙胺类化药物,可抑制角鲨烯环氧化酶,从而抑制功能性真菌细胞膜的发育[17]。由于特比萘芬的治愈率较高,且药物相互作用较少,因此特比萘芬通常优于伊曲康唑[18]。最常见的不良反应是胃肠道症状,头痛和皮疹,但这些通常被认为不足以严重到停止治疗[17];短暂地味觉丧失或改变[17]和症状性肝损伤罕见[1]。另外,特比萘芬隔日口服疗法未经美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)批准用于治疗甲真菌病,但已在临床试验中进行了研究。特比萘芬隔日口服疗法已被证明与连续特比萘芬疗法一样有效[1]。

伊曲康唑 伊曲康唑是一种三唑类药物,可抑制羊毛甾醇14α去甲基化酶,比特比萘芬具有更广的抗真菌活性,对皮肤癣菌、NDMs和念珠菌属均有疗效。最常见的不良反应是头痛、上呼吸道感染、腹泻、腹痛、高甘油三酯血症[18],症状性肝损伤罕见[1]。

氟康唑 氟康唑是一种三唑类药物,其作用与伊曲康唑类似,氟康唑对于皮肤癣菌、念珠菌有抗菌活性,NDMs对氟康唑不敏感[1]。氟康唑口服吸收良好,不受胃和食物pH值的影响。最常见的不良反应是头痛、恶心、皮疹、腹痛[18]。症状性肝酶升高罕见[1]。氟康唑是细胞色素2C9酶的强效抑制剂和细胞色素3A4的中度抑制剂,因此联合用药必须谨慎[18]。

泊沙康唑 泊沙康唑是一种广谱三唑类药物,虽然主要用于预防霉菌和念珠菌引起的侵袭性真菌感染,但对许多皮肤真菌具有体外活性。因其有效性和良好的安全性,已被视为甲真菌病的替代疗法。在一项2B期随机对照试验中,218名甲真菌病患者被平均分为6组,接受了不同治疗方案:泊沙康唑100、200或400 mg,每日1次,持续24周;泊沙康唑400 mg,每日1次,持续12周;特比萘芬250 mg,每日1次,持续12周;安慰剂,持续24周。所有泊沙康唑治疗组在48周时完全治愈患者的比例显著高于对照组,其中泊沙康唑200 mg治疗24周(54.1%)和400 mg治疗24周(45.5%)完全治愈的患者比例较高。另外,此研究有7名患者(182名患者接受泊沙康唑治疗)因无症状肝酶升高而退出治疗,但泊沙康唑总体耐受性良好[19]。

阿巴康唑 阿巴康唑是一种新型三唑类药物,具有体外抗酵母菌和多种丝状真菌和皮肤癣菌的活性。一项2期试验研究了每周使用1次阿巴康唑治疗远端侧位甲下型甲真菌病(distal and lateral subungual onychomycosis,DLSO)的疗效和安全性。584名患者被随机分配到4组阿巴康唑治疗方案中:100 mg,持续36周;200 mg,持续36周;400 mg,持续36周;400 mg持续24周+安慰剂持续12周。在第52周,所有治疗组的有效治疗率(21%～54%)均高于安慰剂组(1%),未观察到严重的肝脏或心脏不良事件[20]。一项关于口服抗真菌药治疗甲真菌病的网络荟萃分析显示,其疗效是依赖剂量的,较高剂量的阿巴康唑可获得较高的治愈率,每周1次400 mg阿巴康唑被认为是最好的治疗方法;安全性方面,该药物耐受性良好,治疗相关不良事件发生率不到3%[21]。

F-RVCZ fosravuconazole L-lysine ethanolate (F-RVCZ)是新型三唑类抗真菌药ravuconazole的一种前药,具有广泛的抗真菌活性[22],日本于2018年批准该药用于治疗甲真菌病[23]。在一项3期随机试验中,比较了F-RVCZ与安慰剂的疗效和安全性,153名患者被随机分配,每天服用一次F-RVCZ(100 mg)或安慰剂,持续12周,在第48周评估完全治愈情况。结果显示,48周时使用F-RVCZ的完全治愈率(59.4%)显著高于安慰剂(5.8%),F-RVCZ的真菌学治愈率(82%)也高于安慰剂(20.0%),23.8%的患者出现轻微药物不良反应[17]。另有一项回顾性研究分析了日本皮肤科门诊使用F-RVCZ治疗甲真菌病的疗效。109名患者12周时的完全治愈率为6.4%,最后一次就诊时的完全治愈率为67.9%[平均最后一次就诊时间:(32±14.2)周]。12周时患甲面积的平均改善率为49.1%±23.3%,最后一次就诊时为86.8%±22.4%[24]。一项前瞻性试验研究了F-RVCZ对65岁以上甲真菌病患者的疗效和安全性,结果显示,总体有效率为83.8%,完全治愈率为29.7%[25]。综上可看出,F-RVCZ是一种很有前途的治疗选择。

奥特康唑(VT-1161) VT-1161是一种新型四唑类抗真菌药,在体外对红色毛癣菌和须癣毛癣菌有抗真菌活性,通过靶向细胞色素51来限制潜在的药物相互作用[18]。一项2期试验评估了四种口服VT1161给药方案与安慰剂对中重度DLSO患者的安全性和有效性。259名患者被随机分为5个治疗组,分别接受300 mg VT-1161每日1次,持续2周,以后每周服用一次,持续10周或22周;或600 mg VT-1161每日1次,持续2周,以后每周服用1次,持续10周或22周;以及一组相匹配的安慰剂组。所有组均接受为期36周的非治疗期。结果显示,安慰剂组的完全治愈率为0,VT-1161治疗组的完全治愈率为32%～42%。VT-1161耐受性良好,没有证据表明对肝功能或QT间期有不良影响[26]。此研究显示出VT-1161具有良好的疗效和安全性,但目前需要更多的临床试验进行进一步评估。

甲真菌病口服药物治疗总结见表2。

表2 甲真菌病口服药物治疗总结Tab.2 Oral antifungal drugs for onychomycosis

表3 甲真菌病局部药物治疗总结Tab.3 Topical antifungal drugs for onychomycosis

2.2 局部药物治疗

8%环吡酮甲涂剂 环吡酮是一种羟基吡啶酮,可螯合三价阳离子,从而抑制金属依赖性酶。它能作用于皮肤癣菌、念珠菌属、一些NDMs以及革兰氏阳性、阴性细菌,对趾甲的真菌学治愈率为29%～36%,完全治愈率为5.5%～8.5%。在使用环吡酮时,建议患者每周修剪指甲,每月接受门诊封包治疗以提高疗效[18]。

10%艾氟康唑溶液 艾氟康唑是一种三唑类药物,可抑制羊毛甾醇14a去甲基化酶,可作用于皮肤癣菌、NDMs和念珠菌。其真菌治愈率为53.4%～55.2%,完全治愈率为15.2%～17.8%。艾氟康唑可作为早期甲真菌病的一线治疗方法,有助于防止高危患者再次感染,对于老年人和免疫功能低下患者来说可能是一种新治疗选择[18]。有资料显示,艾氟康唑使用1年后仍可安全使用,18～24个月的治疗有效率高于使用12个月的有效率[17]。

5% tavaborole溶液 tavaborole是一种硼基溶液,可以抑制指甲板蛋白质的合成,阻止真菌细胞生长[2]。它通过细胞溶质亮氨酸转移RNA(ribonucleic acid)合成酶抑制真菌蛋白质合成。能作用于皮肤真菌、NDMs和酵母菌。由于其体积小、亲水性强,因此能很好地穿透指甲。两个试验的真菌学治愈率分别为31.1%和35.9%,完全治愈率分别为6.5%和9.1%。tavaborole 最常见的不良反应是表皮剥脱、红斑和皮炎[17]。

5% 阿莫罗芬搽剂 阿莫罗芬是一种吗啡啉类药物,具有广谱抗真菌活性,对皮肤癣菌抑制作用强,5%阿莫罗芬搽剂是目前国内推荐的外用药物[1]。一项研究根据每周涂2次或1次的情况,显示出使用阿莫罗芬患者的真菌学治愈率分别为76.1%和70.6%,完全治愈率分别为54.2%和46.0%。另一项研究表明,每日外用5%阿莫洛芬的真菌治愈率和完全治愈率分别为60%和38%[17]。

ME1111 ME1111是一种局部抗真菌药,可抑制红色毛癣菌和须癣毛癣菌中的琥珀酸脱氢酶[18]。与其他药物不同,ME1111的体外抗真菌活性不受 5% 人角蛋白和弱酸性条件 (pH 5.0) 的影响。体外的ME1111在甲深层测得的药物浓度显着高于艾氟康唑、tavaborole、环吡酮和阿莫罗芬,这表明 ME1111 对人类甲蛋白具有出色的渗透性,因此有可能成为新的有潜力治疗甲真菌病的外用药物[27]。

2.3 其他新兴疗法

激光治疗 与口服抗真菌药物比较,激光治疗无明显不良反应,尤其适用于高龄、肝脏功能缺陷对药物过敏的甲真菌病患者,在短期内优势更为显著,依从性更高。目前用于甲真菌病辅助治疗的激光包括1064 nm Nd:YAG激光、CO2激光、半导体激光等[17]。激光治疗只能让甲真菌病患者获得外观上的改善,而不能彻底治愈病甲,其治愈率低于口服治疗好于局部治疗,因此不建议将激光治疗作为甲真菌病的一线治疗[18]。目前,不同研究中采用的激光类型、激光参数、治疗方案等存在较大差异,今后还需更多大样本的临床试验来评估其疗效。

光动力疗法 光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是一种与激光疗法类似的非侵入性疗法。PDT 的原理是使用光激活应用于局部的光敏剂,产生活性氧,启动细胞凋亡。该方法最初是用于光化性角化病, 但它也可以用于真菌感染性疾病[28]。目前研究中的用于治疗甲真菌的光敏剂包括:氨基酮戊酸(ALA)、氨基酮戊酸甲酯(MAL)、亚甲蓝、孟加拉红、Photogem、金丝桃素等[29]。使用PDT治疗甲真菌病的主要问题是光敏剂透过甲板的渗透不足,为了克服这一障碍,大多数研究会使用尿素作为预处理来软化病甲[29]。尽管一些研究已经取得了令人振奋的结果,但目前PDT治疗甲真菌病的研究仍然有限,需要更多的大规模随机对照临床试验来评估其疗效。

3 小 结

由于人口老龄化,甲真菌病越来越普遍。目前传统检测方法还是在临床诊断中占据主要地位,新的检测方法也有各自优缺点,有望逐渐运用到临床诊断中,结合不同的检测方法也有助于提高诊断甲真菌病的准确性。治疗方法上目前以药物治疗为主,口服抗真菌药治愈率高、疗程短,是目前最常用的治疗方法,但有一定不良反应;局部治疗不良反应轻,但治愈率较低,治疗周期较长;激光治疗和PDT对传统疗法无效或有使用禁忌的患者提供了新的治疗选择。一些新型抗真菌药物在治疗甲真菌病方面显示出了良好的效果,比如口服药物F-RVCZ、VT-1161、外用药物ME1111等,在进行更多的临床试验评估后,均有望在未来成为新的临床用药。