高通量测序技术在马尔尼菲篮状菌病临床诊断的应用进展

贾瀚翔 杨英

(军事医学研究院辐射医学研究所,北京 100850)

马尔尼菲篮状菌(Talaromycesmarneffei,NCBI:txid37727)属真菌界(Fungi)子囊菌门(Ascomycota)篮状菌属(Talaromyces),是该属唯一的温度依赖性双相菌[1],在25 ℃环境下呈菌丝相(传播相),在37 ℃则表现为酵母相(致病相)。我国广西、广东地区以及东南亚国家为马尔尼菲篮状菌病(talaromycosis marneffei,TSM)流行区域[2]。中华竹鼠(Rhizomyssinensis)、银星竹鼠(Rhizomyspruinosus)、大竹鼠(Rhizomyssumatrensis)及小竹鼠(Cannomysbadius)是已知的T.marneffei中间宿主,其分布地域与TSM流行区域密切相关[3-4]。人感染T.marneffei可发展为TSM,临床表现包括高热、体重下降、贫血、淋巴结病变、肝脾肿大、呼吸系统症状及皮肤病变等。当患者血液或骨髓中证实存在T.marneffei,或累及多个器官出现全身症状时,定义为播散性TSM,多见于有疫区旅居史的免疫功能缺陷人群[5]。HIV阳性患者更容易发展为播散性TSM,住院死亡率更高;HIV阴性且免疫功能低下的患者,住院死亡率与免疫功能正常的患者相似,但需要更长的住院时间以康复[5]。此外,HIV阴性的播散性TSM患者,因全身多发侵袭的趋势,易被误诊为晚期恶性肿瘤[5]。若患者只有一处受累器官或病变,并无全身症状或体征,则定义为局限型TSM,临床上较为少见[5]。如呼吸道侵入T.marneffei,原发症状与肺结核或其他真菌感染高度相似,导致误诊率高。因漏诊、误诊或延迟诊断错过最佳治疗时机,导致疾病快速进展是TSM患者高死亡率的主要原因。及时确诊T.marneffei感染并进行抗真菌治疗是降低TSM患者死亡率的关键,现就高通量测序技术诊断TSM最新进展进行综述。

1 mNGS应用于T. marneffei感染的快速诊断

mNGS病原检测针对患者标本中的所有核酸序列进行高通量测序,通过生物信息学方法去除人源序列后与病原体数据库查询比对,注释得到检出的病原体信息[6]。在mNGS诊断真菌感染的灵敏度和特异度方面,二代Illumina测序平台可达到91%和89%;而三代Nanopore测序平台可达到91%和100%,并且具有实时检测的特性[7]。

表1是通过检索万方医学网、PubMed文献数据库,并限定出版时间为2020年1月至2022年5月得到的mNGS检出T.marneffei感染的病例报道[8-28]。26例患者年龄分布为7个月至79周岁,表明mNGS无适用年龄限制。表1中的患者从不同部位采集的样本均检出T.marneffei序列,除未提及检测时间的报道外,有13例mNGS检出阳性早于病原体培养,此外还有7例患者组织病理活检或病原体培养结果呈阴性。病原体培养比较容易确诊HIV阳性患者感染T.marneffei,但对于HIV阴性患者,mNGS对T.marneffei的敏感性远高于病原体培养[5],并且mNGS阳性结果可对病原体培养起到一定的提示作用。与此同时,病原体培养周期较长,表1中的患者T.marneffei平均培养周期大于7 d,即使确诊也可能因延迟诊断影响患者预后。目前,mNGS已经可以在7 h内报告检测结果,表1中的患者经mNGS检测获得T.marneffei阳性结果后,因及时应用抗真菌药物进行治疗,其中大部分患者获得了较好的预后。qPCR或血清抗原抗体检测等方法灵敏度高,但需要对疑似病原进行假设,且只能检测到预设的病原体,因此适合作为对于mNGS阳性结果的验证方法。mNGS则无需推测潜在病原,并且可以精确区分物种甚至亚型,尤其适用于新发或罕见病原体的诊断。综上所述,mNGS应用于T.marneffei的快速诊断具有明显优势。

表1 26例经mNGS检出T. marneffei感染的病例报道Tab.1 26 cases of T. marneffei infection detected by mNGS test

目前尚未检索到mNGS检出T.marneffei假阳性的报道。Chen等[24]报道了2例mNGS假阴性结果,在两例样本中分别检出23条、5条T.marneffei序列并判别为背景微生物,后经真菌培养确定两例均为T.marneffei阳性。T.marneffei的基因组较大、细胞壁破壁困难,导致核酸提取效率低。这两例可能由于检出的T.marneffei序列数较少,未达到算法设定的阳性阈值,导致假阴性结果。《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》指出,对于临床关注度高且较难检测的病原菌,可采用独立判读标准,检出1条特异序列即可判别为阳性[29]。因此,对于mNGS阴性结果应慎重对待,需结合临床表现及其他实验结果验证后做临床诊断。

2 WES应用于HIV抗体阴性TSM患者的遗传易感性分析

细胞介导免疫功能受损是人感染T.marneffei的主要因素之一[30]。对于HIV阴性TSM患者,若无器官移植、免疫抑制药物使用或靶向治疗等免疫抑制的情形,则应考虑遗传易感因素,即原发性免疫缺陷导致患者感染T.marneffei的可能性。目前已发现超过400种与PID相关的致病基因,由于PID临床表型和遗传背景呈高度异质性,确诊存在很大困难[31]。WES是将全基因组中编码外显子区域的DNA捕获并富集后进行高通量测序的基因组分析方法,目前已应用于PID一线诊断[32]。

表2是通过检索万方医学网、PubMed文献数据库,并限定出版时间为2020年1月至2022年5月得到的HIV抗体阴性且易感因素不明的TSM患者通过WES诊断为PID的8例报道,测得突变位点分别位于STAT1、STAT3、NFKB2、RELB、TSC2、CARD9等基因[15,21-22,33-36],其中7例应用家系全外显子测序(trio-WES),能够判断从先证者检测到的变异是否遗传自父母,在判断是否为新发(de novo)突变时尤为重要。据报道,STAT1是免疫缺陷31型的致病基因,发生在STAT1的功能性卷曲结构域(coiled-coiled domain)或DNA结合结构域(DNA binding domain)的突变可导致Th1和Th17型炎症细胞因子反应降低,可能提高宿主对T.marneffei的易感性[15, 36]。STAT3突变导致的PID遗传模式复杂,存在外显不全的可能,STAT3的功能缺失影响淋巴细胞发育和功能,可能导致机会性感染[33]。NFKB2属于NF-κB/Rel转录因子家族,是调节感染免疫反应的关键蛋白复合物[15]。RELB参与NF-κB的替代途径[34]。由TSC2基因失活导致TSC2突变介导的mTOR信号通路异常,可能诱发支气管肺发育不良,增加患者对肺部微生物感染的易感性[21]。CARD9是真菌免疫监测的关键分子,主要在巨噬细胞和髓样树突状细胞中表达,通过接收来自多个C型凝集素样受体的信号和刺激促炎症反应,在抗真菌防御中发挥中心作用[22, 35]。综上所述,对于HIV抗体阴性以T.marneffei感染为首发且未发现其他易感因素的患者,尤其是以播散性TSM为首发的儿童患者,需警惕罹患PID的可能性。

表2 8例HIV抗体阴性TSM患者的WES检测结果Tab.2 WES test results of 8 HIV-negative TSM patients

3 展 望

mNGS已成为推动精准医学发展的关键驱动力。为进一步提升mNGS的标准化和规范化程度,全流程自动化平台的建立是mNGS今后的发展方向:自动化核酸提取与建库将湿实验工作流程标准化,在避免人为引入微生物污染的同时,可以大幅提高实验效率;生物信息学分析平台的云端化,提供了安全稳定的运行环境、实时更新的数据库以及标准化的分析流程,显著提升mNGS结果解读的可靠性与时效性。WES是目前临床进行基因诊断的重要技术手段,显著提升了识别临床变异位点的能力。筛选出更多具有临床意义或潜在临床意义的变异位点,需要科研人员与临床密切合作,完善对基因功能的鉴定与验证。随着人类基因突变数据库的不断更新,WES的临床诊断价值必将进一步凸显。