基于气相色谱-离子迁移谱技术的白及及伪品玉竹饮片的快速鉴别

李海洋，王艳丽，岳佑凇，李 涵，侯富国，范雪花，姚 静,3,4,5，施钧瀚,3,4,5，桂新景,,3,4,5*，刘瑞新,3,4,5*

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046

2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

3.河南省中药临床应用 评价与转化工程研究中心，河南 郑州 450000

4.河南中医药大学 呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046

5.河南省中药临床药学中医药重点实验室，河南 郑州 450000

白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f 为兰科植物白及属多年生草本植物，以干燥块茎入药[1]，始载于《神农本草经》：“主痈肿，恶疮，败疽，伤阴，死肌，胃中邪气，赋风，鬼击，痱缓，不收”[2]；《中国药典》2020 年版记载白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒，皮肤皲裂等症[1]。现代研究表明白及有止血、促进伤口愈合、抗菌、抗肿瘤、保护黏膜等药理作用[3-4]。作为一种常用的止血药，白及对育种和生态环境的要求较高[5]，2017 年以前白及的人工栽培技术并不完善，白及药材也主要以野生资源为主[6]，但长期的掠夺式采挖导致其生态环境遭到了严重破坏[7-8]，以至于后来被列入了中国珍稀濒危植物名录（http://www.iplant.cn/rep/protlist）。随着近几年组织培养技术的进一步发展，白及育种困难的问题也得到了有效改善[9]，白及药材的产量也在稳定增长，但前期大范围的盲目引种导致其出现了品种混乱、品质参差不齐的问题[6,10]，还有一些不法商家为牟取更高的利润，在白及饮片中掺入同属的黄花白及、小白及等饮片[6-7]，甚至是掺入其他形状类似的饮片如玉竹、黄精等[11]，导致中药市场一片混乱。如玉竹饮片，因价格较白及饮片低且性状较相似，是白及饮片常见的掺伪品，但其与白及饮片的药效完全不同，掺入到白及饮片中药效必然大打折扣，甚至还可能会引发用药安全事故。因此，开展白及饮片的真伪鉴定研究十分有必要。

现有白及饮片的真伪鉴定方法主要包括经验鉴别方法、显微鉴别方法、药典的理化鉴别等方法[11]，也有研究人员将分子鉴定技术应用于白及饮片的真伪鉴定[12]，拓宽了鉴别方法与手段，为中药的鉴定提供了更多的选择，而不同方法各有所长，如传统经验鉴别和显微鉴别速度快，HPLC鉴定技术准确可量化，分子鉴定技术溯源更准确、可靠，但也普遍存在一些局限性，如经验鉴别主观性强，显微鉴别专属性不强，HPLC 鉴定操作繁琐耗时[13]，分子鉴定技术难度相对较高，且目前常用的DNA 提取和特异性PCR 技术耗时较长等[14]。因此，亟需根据白及饮片的特性（挥发性成分复杂多样[15]）探索新的快速、准确的真伪鉴定方法，这对于完善中药饮片的快速鉴别体系也有重要的意义。

气相离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一种痕量挥发性有机物快速分析技术，其结合了气相色谱的高分离性能和离子迁移谱快速响应、高灵敏度的优势，且仪器操作简单，样品前处理简便快捷[16]，目前在食品、医药等领域已有广泛应用[17-19]，在中药材年份区分[20]、品种鉴别[16]、炮制工艺优化[21]、不同花期中药的成分分析[22]等方面也发挥了重要的作用。基于此，本实验以常见伪品玉竹饮片为例，运用GC-IMS 技术开展白及饮片和玉竹饮片的挥发性有机物的差异对比研究，探索适合白及饮片的快速真伪鉴别方法。

1 材料

1.1 仪器

FlavourSpec®风味分析仪［德国GAS 公司，配套有分析软件包括 Laboratory Analytical Viewer（LAV）和Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA 三款插件以及GC×IMS Library Search Software 定性软件］，QUINTIX224-1CN 型万分之一电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

1.2 试药

5 批白及饮片和5 批玉竹饮片购自于河南中医药大学第一附属医院、河南中医药大学第三附属医院、1 家药店及成都荷花池中药材市场，样品产自云南、贵州、湖南等地，具体信息见表1，经河南中医药大学第一附属医院施钧瀚等多名主任/副主任药师共同鉴定，样品白及饮片为兰科植物白及B.striata(Thunb.) Reichb.f 块茎的炮制品，样品玉竹饮片为百合科植物玉竹Polygonatumodoratum(Mill.) Druce 根茎的炮制品。

表1 白及饮片和玉竹饮片信息与来源Table 1 Information and sources of B.striata decoction pieces and P.odoratum decoction pieces

2 方法

2.1 样品处理

分别精密称取各样品（粗粉）1.0 g，置于20 mL顶空瓶中，80 ℃孵育20 min 后进样500 μL。每个样品平行进样2 次。

2.2 检测条件

顶空进样条件：孵化温度80 ℃；孵化时间20 min；孵化转速500 r/min；进样针温度85 ℃；进样体积 500 μL。气相色谱条件：色谱柱FS-SE-54-CB-1 15 m ID:0.53 mm，柱温60 ℃，载气流量：0～2 min，2 mL/min；2～20 min，2～100 mL/min；20～30 min，100 mL/min。IMS 条件：载气/漂移气为N2，IMS 温度45 ℃，漂移气体积流量150 mL/min。

2.3 数据处理与分析

使用Microsoft Office Excel 2016 统计数据；基于Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件，根据组分特征峰对应的保留时间和迁移时间，利用内置NIST 数据库和IMS 数据库对样品挥发性有机物进行定性，结合Reporter 插件、Gallery Plot 插件对样品挥发性有机物进行分析，并采用SIMCA14.1对指纹图谱筛选的差异峰进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA）；使用Matlab 2016b 的classification_toolbox_6.0 工具箱中的K 最邻近（K-nearestneighbor，KNN）分类算法和支持向量机（support vector machine，SVM）二分类方法，基于筛选的差异峰开展2 种饮片的分类预测。

3 结果与分析

3.1 白及饮片与玉竹饮片GC-IMS 谱图的初步对比分析

基于GC-IMS 法采集到样品挥发性有机物信息，通过生成三维谱图（图1-A）和二维俯视图（图1-B 和图1-C），可直接对比样品间的挥发性有机物差异，其中三维图的X、Y、Z 轴分别代表迁移时间、保留时间和峰强度；俯视图的横、纵坐标分别为离子迁移时间（归一化处理）、气相色谱的保留时间，横坐标1.0 处红色竖线为反应离子峰（Reactive ion peak，RIP，经归一化处理），RIP 峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物，颜色代表有机物的浓度，颜色越深表示浓度越大，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高[23]。基于Matlab 语言的随机数选取语法，随机选取BJ34和YZ78 对比白及饮片和玉竹饮片的GC-IMS 三维谱图和俯视图，从图中可以看出白及饮片和玉竹饮片之间挥发性有机物的种类和含量存在一定程度的差异。为更直观地对比不同样品的差异，以BJ34 的谱图作为参比，YZ78 的谱图扣减参比后再比较两者的挥发性有机物差异，结果如图1-D。如果二者挥发性有机物一致，则扣减后的背景为白色，蓝色代表该物质的浓度低于参比，如区域a；红色代表该物质的浓度高于参比，如区域b。从图1-D 中可以看出BJ34 与YZ78 的多种挥发性有机物在含量上均存在较大的差异，这与三维谱图和俯视图的观察到的结果一致。

图1 样品的气相离子迁移谱图及差异图Fig.1 GC-IMS diagram plots and difference diagram plots of samples

3.2 白及饮片与玉竹饮片挥发性有机物的定性分析

采用软件内置的NIST 和IMS 数据库分别对白及饮片和玉竹饮片的挥发性有机物进行定性分析，共确定了61 种挥发性有机物，见图2 与表2。其中，醇类化合物共有15 种，占24.59%，醛类化合物共有15 种，占24.59%，酯类化合物有5 种，占8.20%，酮类化合物共有17 种，占27.87%，另外还有酸类、烷烃类、烯烃类、吡嗪类、吡啶类、噻唑类、呋喃类化合物，占14.75%。同时，还发现有10 种挥发性有机物同时存在单体和二聚体，如图2 中序号3、序号4 代表的化合物正戊醇具有相同的保留时间，其中序号3 代表化合物的单体，序号4 代表化合物的二聚体，研究发现二聚体或多聚体的形成与相关化合物的浓度等有关[24]，目前普遍认为当单体、二聚体同时出现时可更加精准地对化合物进行定性[25-26]。

图2 白及饮片 (A) 和玉竹饮片 (B) 气相离子迁移谱图Fig.2 GC-IMS diagram plots of B.striata decoction pieces (A) and P.odoratum decoction pieces (B)

表2 气相离子迁移谱图定性结果Table 2 Qualitative results of GC-IMS diagram plots

3.3 白及饮片与玉竹饮片挥发性有机物指纹图谱整体对比与分析

为更直观对比不同饮片挥发性有机物的差异，使用LAV 软件的Gallery Plot 插件对2 种中药饮片进行指纹图谱分析。结果见图3，图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，从图中可以看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。通过对比5 个不同批次白及饮片和玉竹饮片的挥发性有机物的峰强度，结合表2 的峰体积均值，可以看出2 种饮片的部分挥发性有机物的含量存在明显差异，如区域B 的大部分挥发性有机物；同时还发现同一饮片不同批次间的含量差异也比较大，如区域A 的化合物在不同批次白及间的含量差异较显著，BJ4 和BJ14 中的含量明显高于其他批次；同样地，区域D 的化合物30、5 等在不同批次玉竹的含量差异也比较显著，推测可能是产地不同、储存条件不一致、储存年限不同等导致同种饮片挥发性有机物存在较大的差异，但也不排除饮片本身的质量参差不齐的可能。同时，区域A、B 的化合物在白及中的含量相对玉竹的含量整体较高，即以上区域所包含的2,3-戊二酮、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮（二聚体）、甲基庚烯酮、糠醇（单体）、反式-2-壬烯醛、2-庚酮、4-甲基-2-戊酮（二聚体）和未知化合物22、11、24、3 等共计53 种化合物可作为识别白及饮片的特征挥发性有机物；区域D 所包含的化合物在玉竹中的含量明显更高，可作为玉竹的特征挥发性有机物，即1-辛烯-3-醇、糠(基)硫醇、顺-2-戊烯-1-醇、异戊酸、3-辛酮、5-甲基呋喃醛、莰烯、醋酸乙酯和未知化合物14、15、58、37、38、46 等共计38 种化合物可作为识别玉竹饮片的特征挥发性有机物。而在区域C 的挥发性有机物在2 种中药饮片的含量差异较小，难以作为区分2 种饮片的挥发性有机物。

图3 白及饮片和玉竹饮片的挥发性有机物指纹图谱Fig.3 Fingerprint chromatogram of volatile organic compounds in B.striata decoction pieces and P.odoratum decoction pieces

3.4 基于化学计量学分析方法的白及饮片与玉竹饮片的分类辨识

为判断通过指纹图谱中含量差异筛选的白及饮片和玉竹饮片特征挥发性有机物的准确性，进一步评价GC-IMS 技术用于白及饮片快速真伪鉴别的可行性。将筛选出含量差异较大的91 种挥发性有机物的峰体积作为变量，导入SIMCA14.1 软件进行无指导的PCA 和有指导的OPLS-DA，并借助Matlab 2016b 的classification_ toolbox_ 6.0 工具箱中的KNN 分类算法和SVM 二分类方法，基于筛选的差异峰对2 种饮片进行分类预测。通过PCA 的得分图（图4-A）发现白及饮片和玉竹饮片间有较好的分离，前2 个主成分的贡献率分别是40.00%和31.70%，模型前7 个主成分的累积贡献率R2Xcum是0.980，模型的预测能力Q2cum是0.881，说明模型的预测性能良好。在PCA 的基础上建立有指导的 OPLS-DA 模型进行分析（图4-B），表征模型性能的参数R2Ycum和Q2cum分别是0.991 和 0.987，且模型的分类预测正判率为100%，说明模型具有极好的分类效果，采用Permutation Tast 对OPLS-DA 模型进行置换检验（n＝200 次），判断模型的预测性能，结果如图4-C，可以看出所有左侧的Q2、R2值都比右边的原始点低，Q2的回归线与纵轴（左边）相交于0.05以下，且R2值均大于0，表明建立模型的预测能力良好，即上述筛选的含量差异较大的91 种挥发性有机物可作为辨识白及饮片和玉竹饮片的参考指标。不同挥发性有机物峰体积的OPLS-DA 模型的变量重要性投影（ variable importance projection，VIP）见图4-D，VIP 值越大表明该有机物峰体积差异对两者分类的贡献越高。

图4 白及饮片和玉竹饮片挥发性组分差异峰的多元统计分析图Fig.4 Multivariate statistical analysis of difference peaks of volatile components in B.striata decoction pieces and P.odoratum decoction pieces

结果显示VIP 值＞1 且P＜0.05 的挥发性有机物共有21 种（红框标注，化合物11 的VIP 值＞1但P＝0.08），其中能够定性识别的挥发性有机物共有13 个，包括4-甲基-2-戊酮（二聚体）、2-庚酮、莰烯、反-2-辛烯醛（单体）、糠（基）硫醇、5-甲基-2-呋喃甲醇（二聚体）、反式-2-壬烯醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-己烯醛（二聚体）、甲基庚烯酮、5-甲基-2-呋喃甲醇（单体）、反-2-辛烯醛（二聚体）、醋酸丁酯；未定性挥发性有机物8 种，分别是化合物41、36、18、4、65、27、45、64。上述21 种挥发性有机物可作为白及饮片和玉竹饮片分类辨识的重要指标，可为2 种饮片的快速真伪鉴定提供参考。另外，经SVM 和KNN 方法进行二分类模型预测，结果显示2 种饮片分类的正判率均为100%。综上，基于指纹图谱的含量差异筛选的差异峰进行化学计量学分析后，可实现2 种饮片极好的分类效果，即GC-IMS 方法可用于白及饮片和玉竹饮片的快速真伪鉴定。那么如何充分利用GC-IMS 技术快速、痕量检测的优势，从而快速实现未知中药饮片/中药材的快速鉴别是一个亟待解决的问题，下面作者就现有实验数据为基于GC-IMS 技术的中药快速鉴别研究提供方法和思路借鉴。

基于本研究测定的实验数据，首先选取2 个对2 种饮片分类辨识贡献率高、且分别在2 种饮片中各具有较高含量的代表性挥发性有机物成分建立快速判别参考指标。经筛选，选用4-甲基-2-戊酮（二聚体，BJ 中含量高）和莰烯（YZ 中含量高）2种挥发性有机物的峰体积做为参比（n＝5，2 次平行进样取平均值），其中BJ 饮片4-甲基-2-戊酮与莰烯的峰体积比值的均值为7.69±2.17（n＝5），YZ饮片4-甲基-2-戊酮与莰烯的峰体积比值的均值为0.42±0.16（n＝5）。在置信水平为95%的条件下，计算BJ 和YZ 饮片4-甲基-2-戊酮和莰烯比值的置信区间分别为[4.99, 10.38]和[0.22, 0.62]，即在置信水平为95%时，当一种未知饮片的上述2 种成分峰体积比值位于[4.99, 10.38]之间时，该饮片可能是白及；2 成分比值位于[0.22, 0.62]之间时，该饮片可能是玉竹，反之当上述2 种成分峰体积比值在以上2 个区间范围外时，判断该饮片应为白及和玉竹以外的其他饮片。基于本实验得到的数据，作者为快速鉴别白及饮片和玉竹饮片提供了一个参比指标，上述方法基于GC-IMS 技术为快速鉴别白及饮片和玉竹饮片提供了新的思路，同时基于本思路还可为其他饮片的真伪鉴别甚至是掺伪鉴别等研究提供借鉴。

4 讨论

基于“气味”信息的中药快速鉴别是中药传统性状鉴别方法的重要组成部分[27]，如鱼腥草有强烈的鱼腥味、香加皮有特殊的香味，经验丰富的药工可直接根据中药的独特气味及气味厚薄程度快速鉴别其真伪甚至评价其优劣，凭借其快速、便捷的优势，这类方法作为一种传统的鉴别技术流传至今，但对于一些气味信息不丰富、甚至是气味微弱的饮片，可能难以通过传统“鼻闻”的方法快速实现中药的鉴别。GC-IMS 技术作为一种挥发性有机物痕量检测技术，巧妙地将传统性状鉴别的快速和现代仪器分析精准、量化的优势结合起来，可用于快速、精准检测中药挥发性有机物的信息，实现了传统技艺的传承与发展。目前该技术在食品、农业和医药等领域已有较多应用，主要用于样品挥发性有机物的快速检测与定性，以及不同样品间挥发性有机物含量差异的对比分析，且已有较多研究表明GC-IMS 技术可用于2 种/多类样品的鉴别或分类[20,23]，但目前仍未见相关研究提出用于快速鉴别2 类样品的方法或思路。本研究基于该技术，以白及饮片和玉竹饮片为例，借助化学计量学等方法探索了一种可用于白及饮片快速真伪鉴别的参考方法。

本研究基于GC-IMS 技术，在玉竹饮片和白及饮片中快速检测出了126 种挥发性有机物，并获取了它们的相对含量信息，经软件内置的NIST 和IMS数据库定性出61 种挥发性有机物，结合指纹图谱对比两者挥发性有机物的种类和含量差异，发现区域A 和区域B 的绝大多数挥发性有机物在白及中的含量明显高于玉竹饮片，区域D 的挥发性有机物在玉竹中的含量更高，这些成分都是鉴别2 种饮片的重要参考指标。然后通过VIP 值和P值明确了21 种可用于白及饮片和玉竹饮片分类辨识的差异标志物，并借助统计学分析手段，基于选定的差异标志物的比值为白及饮片和玉竹饮片的快速真伪鉴定提供了参考指标及范围，提出了一种用于白及饮片快速真伪鉴别的方法，为中药饮片的快速质量评价提供了新的借鉴思路。另外，通过分析指纹图谱还发现同一饮片不同批次间存在明显的差异，如区域A的化合物在BJ4 和BJ14 中的含量与其他批次的白及饮片存在较大的差异，玉竹饮片的组内差异也比较突出，仅有个别挥发性有机物的含量具有较高的相似性，如图3 区域D 的未定性化合物18、27、4、63、65、48。而造成挥发性有机物差异的原因，可能是由于产地或生长年限不同造成的影响，另一方面也可能是储存条件或储存年限不一致导致的。尽管挥发性有机物不是两者的最主要药效成分，但仍是饮片整体质量的重要体现，挥发性有机物出现含量差异的同时其他成分是否也会受到影响暂不能确定，以及挥发性有机物的差异是否直接或间接影响药物疗效也需进一步研究探索。

尽管本实验设计的样本量整体较少，可能一定程度上影响2 种饮片挥发性有机物含量差异分析的结果，但通过OPLS-DA、KNN、SVM 等方法建立的分类辨识模型的预测准确率比较理想，且经过留一法交互验证（20 样本）得到KNN、SVM 模型的预测准确率均为100%，同时为避免样品平行2 次测定的数据会对模型的构建产生一定的影响（即机器学习模型时出现数据泄露的风险），故将2 次平行进样的峰体积求得平均值后，再次经留一法交互验证（10 样本）检测模型的预测性能，模型分类辨识的正判率仍为100%，表明本研究建立的模型可以实现两饮片的准确鉴别，后续也将考虑通过增加样本量的方式进一步完善此类研究方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突