四环素对不同品种蔬菜毒性阈值及其敏感性分布

黄世聪，陈丽珂，张政杰，陈科华，陈澄宇，曾巧云*

1. 华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510642；2. 广州造纸集团有限公司，广东 广州 511462

四环素（TC）是畜禽粪肥中普遍存在的典型抗生素（Zhou et al.，2020），长期大量施用畜禽粪肥势必导致农业土壤TC 污染（曾巧云等，2018；丁丹等，2023；Wu et al.，2023）。土壤TC 污染不仅能够诱导、筛选和滋生出抗生素耐药菌（ARB），危害人类健康和生态安全（Guo et al.，2021；Wang et al.，2022）。同时，农田土壤TC 污染还会破坏作物叶绿体结构和叶肉细胞超微结构，降低细胞膜通透性，引起作物的氧化应激，从而抑制作物的生长发育（Khan et al.，2021）。蔬菜生产基地强调畜禽粪肥等有机肥的施用，较高的复种指数和施肥频率导致蔬菜基地土壤TC 污染尤为严重（Sun et al.，2021；Li et al.，2023）。施用畜禽粪肥蔬菜基地土壤中TC含量为102 μg·kg-1，超过喹诺酮类（86 μg·kg-1）、磺胺类（1.1 μg·kg-1）和大环内酯类（0.62 μg·kg-1）的含量（Li et al.，2023），也超出了兽药国际协调委员会（VICH）筹划指导委员会提出的土壤抗生素生态毒害效应的触发值（100 μg·kg-1）。因此，TC 污染对蔬菜生长发育的影响应受到重视。

种子发芽率、芽伸长和根伸长经常被作为环境污染物对受试作物毒性效应的关键指标（An et al.，2009）。目前，国内外关于TC 等抗生素对作物毒性的研究方法也主要是通过种子萌发实验，考察抗生素污染胁迫下作物种子发芽和生长情况，然后综合评价其毒性（Luo et al.，2019a；张天莹等，2021；赵肖琼等，2022）。10—100 mg·L-1的TC 处理下，小麦种子萌发芽长与根长分别下降7%—73%和41%—84%（Han et al.，2021）。但作物对TC 污染的毒性响应存在种间和种内差异（张乙涵等，2014；Luo et al.，2019b）。以毒性数据为基础的物种敏感性分布法（Species sensitivity distributions，SSD）不仅能体现多物种间的敏感性差异，降低将单一物种的毒理学数据外推到其他物种的不确定性，还可以利用适当的模型和统计分布软件对毒性数据进行拟合，从而获得环境中95%的物种不受危害时的最大污染物浓度（HC5），并在此基础上计算污染物的预测无效应浓度值（PNEC）（Wan et al.，2020；Gu et al.，2021；Kamo et al.，2022），是目前环境污染物生态风险评估的重要方法。但目前关于TC 污染对某一特定区域多种品种蔬菜毒性阈值及物种敏感性分布的研究报道还较少（张乙涵等，2014）。

因此，本文采用室内培养方法，选取TC 作为代表性抗生素，调查其对珠三角地区广泛种植的蔬菜品种种子发芽率、芽长和根长的影响；并选用影响程度较大的指标，采用Log-logistic 分布模型，对TC 的毒性剂量-效应关系进行拟合，获得TC 污染对不同品种蔬菜毒性的剂量-效应曲线，并计算其相应的IC50和IC10；以IC50为评价参数，采用SSD法，构建TC 污染对不同品种蔬菜的SSD 曲线，并获得基于保护95%的蔬菜品种的TC 毒性阈值（HC5）和无效应浓度（PNEC），从而为土壤TC 污染的生态风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

四环素（tetracycline，TC）购买于阿拉丁试剂公司，纯度级别为USP（美国药用级别）。供试蔬菜种子购自广东省农业科学院蔬菜研究所种子市场，通过种子发芽预实验弃去发芽率小于90%的品种，最终确定9 种南方常见蔬菜品种种子作为后续实验对象，包括，白菜（BrassicapekinensisL.）、白瓜（CucurbitapepoL.）、菜心（BrassicaparachinensisL.）、豆角（Vigna unguiculataL.）、花叶芥菜（BrassicajunceaL.）、芥兰（BrassicaalboglabraL.）、青瓜（CucumissativusL.）、线椒（CapsicumannuumL.）和玉米（ZeamaysL.）。

1.2 实验方法

种子发芽实验采用培养皿滤纸法。根据预实验结果，设置正式实验溶液中TC 的质量浓度为0、0.1、1、10、30、50、100、300 和500 mg·L-1。用质量浓度为0.1%的次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min，用去离子水冲洗2 遍，取出置于棉纱布内。挑选大小相近、品相良好、籽粒饱满的种子均匀排列在铺有两层滤纸的培养皿（直径为90 mm）中，视种子大小确定放入种子粒数，白菜、菜心、花叶芥菜和芥兰放置20 粒种子，其余品种均放置15 粒种子，保持种子的朝向一致，然后分别加入不同质量浓度TC 溶液10 mL。每个处理设置3 个重复。

以上步骤处理好后盖上玻璃培养皿，称重并记录重量，然后将培养皿放置于30 ℃的培养箱避光培养。每日观察种子的萌发情况，并采用恒重法来维持培养液的体积。当对照组内种子发芽率大于90%并且45%—55%的种子的芽长大于20 mm 时停止培养（张乙涵等，2014）。

取出培养皿，统一切断根和芽，使用电子示数游标卡尺测定各品种蔬菜种子的芽长和根长，并以对照组样品的芽长和根长为基准（100%），计算各处理种子相对芽长和相对根长，具体见式（1）和式（2）。

式（1）中：

l1——各处理种子相对芽长，%；

ls——各处理种子的芽长，cm；

ls0——对照组种子的芽长，cm。

式（2）中：

l2——各处理种子相对根长，%；

lr——各处理种子的根长，cm；

lr0——对照组种子的根长，cm。

1.3 TC 对不同品种蔬菜种子毒性的剂量-效应曲线拟合及修正

TC 对不同品种蔬菜种子毒性的剂量-效应关系曲线采用Log-logistic 分布模型进行拟合，具体见式（3）。然后使用OriginPro 8 的定位功能，寻找当y分别为90%和50%时，ρ的数值，即IC10和IC50。

式中：

y——各处理种子相对根长，%；

y0、b——拟合的参数，由软件自动生成；

ρ——TC 质量浓度值，mg·L-1；

m——ICρ的自然对数值，由软件自动生成。

当TC 在低质量浓度时会对种子萌发和生长产生刺激效应，可采用低剂量污染物刺激效应（hormesis）曲线进行修正，并将横坐标轴改为以10为底的对数坐标轴。拟合可用OriginPro 8 软件来完成，方程如式（4）所示。

式中：

Y——植物相对含量或相对生物量，%；

ρ——TC 的质量浓度，mg·L-1；

a、b、c、d——方程参数，由曲线拟合时自动生成。

当k为10、50 时，参数c定义为IC10及IC50，由曲线拟合时自动生成。

1.4 TC 对不同品种蔬菜毒性的敏感性分布曲线拟合

目前常用于拟合SSD 曲线的分布模型包括Burr-Ⅲ、Log-logistic、Log-normal 以及Log-triangular等。根据文献研究结果（Li et al.，2018），本文采用Burr-Ⅲ模型（式 (5)）及相应BurrliOZ 统计软件，选用IC50作为物种敏感性分布的指标（根据公式 (3)和 (4) 得到IC50），获得TC 对不同品种蔬菜毒性的敏感性频次（SSD）分布曲线。

式中：

ρ——溶液中TC 的质量浓度，mg·L-1；

b、c、k——函数的3 个参数，由曲线拟合时自动生成。

1.5 生态风险阈值（HC5）和预测无效应浓度（PNEC）的计算

根据1.4 中物种敏感性分布曲线，计算得到TC的HC5，然后根据式（6）获得TC 的PNEC（Gu et al.，2021）。

式中：

ρ(PNEC)——TC 的预测无效应质量浓度，μg·L-1；

ρ(HC5)——TC 的生态风险阈值，μg·L-1；

K——评价因子，在生态毒性试验中取值通常为5（Gredelj et al.，2018）。

1.6 数据处理和分析

采用Microsoft Excel 2016 对实验数据进行整理，文中所有实验数据均为平均值±标准误（n=3）；使用SPSS 17.0 对数据进行单因素方差分析及多重比较（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 TC 污染对蔬菜种子发芽率的影响

TC 污染对试验品种蔬菜种子发芽率的影响见图1。

图1 不同质量浓度TC 污染处理下蔬菜种子的发芽率Figure 1 Germination rates of vegetables seeds under TC contamination treatment

从图1 可以看出，随TC 污染质量浓度的增加，9 种试验品种蔬菜种子的发芽率总体呈下降趋势，且随蔬菜品种的不同而不同。除玉米外，其余8 种蔬菜发芽率保持在75%以上。当TC 质量浓度为100 mg·L-1时，除白瓜种子的发芽率低于90%以外，其他品种蔬菜种子发芽率均大于90%；当TC 质量浓度为500 mg·L-1时，除白瓜、芥兰和玉米种子的发芽率低于80%以外，其他品种蔬菜种子发芽率均大于80%。

2.2 TC 污染对蔬菜种子芽伸长的影响

试验品种蔬菜种子芽长对TC 污染的响应（见图2）可以归为两种类型。第一种类型为敏感型。低质量浓度TC 处理下，种子芽长即呈现出显著下降，且种子芽长下降程度随TC 质量浓度的增加而增加，如白瓜和青瓜种子。当TC 质量浓度为0.1 mg·L-1时，种子芽长分别是对照处理的73.4%（白瓜）和77.9%（青瓜），差异显著；当TC 质量浓度为10 mg·L-1时，种子芽长仅为对照处理的42.3%（白瓜）和57.8%（青瓜）。第二种类型为低质量浓度促进高质量浓度抑制型，即低质量浓度TC 处理对种子芽伸长具有一定的促进作用，高质量浓度TC处理抑制种子芽伸长。本实验中，除白瓜和青瓜种子以外，其他品种蔬菜种子均属于第二种类型。以花叶芥菜为例，当TC≤1 mg·L-1时，对种子芽长具有一定的促进作用，相对芽长大于对照处理，TC 质量浓度为1 mg·L-1时，相对芽长为对照处理的111.2%，差异显著；但当TC＞1 mg·L-1时，对种子芽长具有抑制作用，且抑制程度随TC 质量浓度的增加而增加，当TC 质量浓度为10 mg·L-1和100 mg·L-1时，相对芽长分别为对照处理的84.1%和51.2%，差异显著。

图2 不同质量浓度四环素污染处理下蔬菜种子的相对芽长Figure 2 Relative shoot elongation of vegetables seeds under different TC contamination treatment

2.3 TC 污染对蔬菜种子根伸长的影响

试验品种蔬菜种子根伸长对TC 污染的响应类型（见图3）与芽伸长相似。第一种类型为敏感型，如白瓜、豆角、青瓜和玉米种子。以白瓜种子为例，当TC 质量浓度为0.1 mg·L-1和1 mg·L-1时，白瓜种子相对根长分别为45.5%和56.7%，显著低于对照处理。第二种类型为低质量浓度促进高质量浓度抑制型，如白菜、菜心、花叶芥菜、芥兰和线椒种子。以芥兰种子为例，当TC 质量浓度为0.1 mg·L-1和1 mg·L-1时，相对根长分别为153.1%和140.1%，显著高于对照处理；而当TC 质量浓度为100 mg·L-1和300 mg·L-1时，相对根长分别为23.8%和10.9%，显著低于对照处理。

图3 不同质量浓度四环素污染处理下蔬菜种子的相对根长Figure 3 Relative root elongation of vegetables seeds under different TC contamination treatment

从图2 和图3 可以看出，TC 污染对试验品种蔬菜种子根长的影响程度大于芽长。本实验质量浓度范围内，TC 污染对豆角种子芽长的影响范围为112.0%—43.8%，而对根长的影响范围为96.0%—24.3%；对玉米种子芽长的影响范围为73.3%—129.4%，而对根长的影响范围为84.7%—26.5%。因此，本文以蔬菜种子根长作为测试终点来评价TC污染对不同品种蔬菜的毒性阈值。

2.4 TC 污染对不同品种蔬菜种子根伸长的剂量-效应关系

经污染物低剂量刺激效应修正后，TC 对不同品种蔬菜种子根伸长的剂量-效应的关系曲线见图4，并获得10%和50%根长抑制质量浓度及置信区间，见表1。

表1 基于蔬菜根长的TC 毒性阈值与95%的置信区间Table 1 Toxicity thresholds of TC based on vegetable root elongation and 95% confidence intervals

图4 蔬菜根长与四环素添加质量浓度的剂量-效应曲线Figure 4 Dose-response curves of added TC on root elongation of vegetables

如图4 所示，随着溶液中TC 质量浓度的增加，9 种试验品种蔬菜种子根长逐渐下降。当TC 质量浓度为1 mg·L-1时，根长开始急剧下降；当质量浓度达到500 mg·L-1时，除豆角和玉米种子以外，其他品种蔬菜种子相对根长低于10%，甚至接近“0”，基本停止生长。

从表1 可以看出，TC 对不同品种蔬菜的毒性阈值差异较大，IC50值最小为2.98 mg·L-1（青瓜），最大值为83.60 mg·L-1（玉米）；IC10值最小0.03 mg·L-1（玉米），最大值为5.63 mg·L-1（芥兰）；且从IC50和IC10大小排序来看，不同品种蔬菜对TC的敏感性程度并非一致，如，玉米种子的IC50最大，但IC10最小。

2.5 TC 污染对不同品种蔬菜种子毒性的敏感性分布及HC5、PNEC

从TC 污染对不同品种蔬菜种子毒性（基于根长IC50）的SSD 曲线（图5）可以看出，不同品种蔬菜对TC 污染毒性的敏感性频次分布拟合效果较好，其敏感性分布频次的大小顺序为：玉米＞菜心＞芥兰＞豆角＞白菜＞线椒＞花叶芥菜＞白瓜＞青瓜。即，玉米种子对TC 污染的耐受性最强，其次为菜心；青瓜种子对TC 污染最敏感。

图5 不同品种蔬菜种子基于根长IC50的SSD 曲线Figure 5 SSD curve of different species of vegetables seeds based IC50 of their root elongation

Burr-Ⅲ分布模型拟合结果表明，本实验中，TC对不同品种蔬菜种子的HC5为9.64 μg·L-1，PNEC为1.93 μg·L-1。

3 讨论

本实验设置质量浓度范围内，TC 污染对9 种蔬菜种子发芽率具有不同程度的抑制作用，而对于除白瓜和青瓜种子的芽长和根长，以及豆角和玉米根长以外的指标，则表现出低质量浓度TC 具有促进作用，高质量浓度TC 具有抑制作用。0.1 mg·L-1的TC 污染处理下，菜心种子的相对芽长和相对根长分别为123.2%和125.6%，显著高于对照处理；1 mg·L-1的TC 污染处理下，线椒种子的相对芽长和相对根长分别为119.4%和115.0%，显著高于对照处理。这可能是由于低质量浓度的抗生素污染提高了植物的应激能力，促使植物加强自身蛋白质的合成以抵抗抗生素的毒害作用，从而表现出低质量浓度抗生素对根伸长的促进作用（陈敏杰等，2019）。这种抗生素对植物根长的“低促高抑”的现象也存在于前人的研究中。如，土霉素（OTC）质量浓度为0—9.38 mg·L-1时，小白菜、甘蓝、大白菜、玉米、豇豆、生菜和黄瓜等蔬菜种子相对根长均有促进作用，而当OTC 质量浓度达到37.5 mg·L-1时，根伸长开始受到抑制，且其抑制程度随OTC 质量浓度的升高而增加（姚洪伟等，2019）。

一般来说，污染物对种子萌发指标的影响程度为：根长＞芽长＞发芽率，即，根长对环境污染物的敏感程度最高，发芽率对环境污染物的敏感程度最低。这可能是由于植物的根系直接暴露在外界环境中，与污染物直接接触，对污染物的响应也最直接（保琼莉等，2020；李柯等，2020；周睫雅等，2020）；而种皮构成了种胚与外界环境之间的屏障，阻止环境中的污染物进入种皮内部，使得发芽率受外界污染物的影响程度最小（Araújo et al.，2005）。芽长对环境污染物的敏感程度介于发芽率和根长之间，这可能是由于种子发芽时可以从胚内获取养分，即使在根的生长受到抑制时，芽的伸长还可以吸收种子的养分而不受抑制（金彩霞等，2009）。已有文献研究表明，TCs 污染对种子萌发的影响也表现出同样的规律，即，根长＞芽长＞发芽率（鲍艳宇等，2008；葛成军等，2012）。如，OTC 和金霉素（CTC）污染（50 mg·L-1）下，白菜种子根伸长分别下降了60%（OTC）和30%（CTC），而种子发芽率的响应不明显（葛成军等，2012）；TC 污染（≤300 mg·L-1）对莴苣等4 种蔬菜种子的根伸长抑制作用大于芽伸长的抑制作用（Pan et al.，2016）。本文TC 污染（≤500 mg·L-1）对9 种蔬菜种子萌发指标的影响程度为：根长＞芽长＞发芽率，当TC 质量浓度为10 mg·L-1时，9 种品种蔬菜种子相对根长、相对芽长和发芽率分别为16.9%—72.5%，42.3%—129.4%，83%—100%，与文献研究结果相一致。

抗生素对种子萌发过程中根伸长的影响与种子品种有关。当OTC 质量浓度达到10 mg·L-1时，小麦种子根长出现明显缩短，而玉米和高梁种子根长出现明显缩短的质量浓度分别为20 mg·L-1和40 mg·L-1时（王磊等，2017）。当TC 质量浓度为100 mg·L-1时，番茄的相对根长小于20%，而玉米的相对根长大于50%（张乙涵等，2014）。生菜、苜蓿和胡萝卜种子（Hillis et al.，2011），以及生菜、胡萝卜、黄瓜和西红柿种子（Pan et al.，2016）对TC 污染的响应程度也存在显著差异。本文9 种蔬菜种子萌发对TC 污染的响应程度变化较大，如，当TC 质量浓度为10 mg·L-1时，玉米、青瓜和白瓜种子的相对根长分别为72.5%、35.9%和16.9%，差异显著。

以根长作为测试终点，TC 对9 种蔬菜的IC50值最大值为83.60 mg·L-1（玉米），最小值为2.98 mg·L-1（青瓜）；IC10最大值为5.63 mg·L-1（芥兰），最小值为0.03 mg·L-1（玉米）；且从IC50和IC10大小排序来看，不同品种蔬菜对TC 的敏感性程度并非一致，如，玉米种子的IC50最大，但IC10最小。Liu et al.（2009）的研究表明，TC 对黄瓜种子的IC50（203 mg·L-1）显著高于水稻种子（69 mg·L-1）和燕麦种子（57 mg·L-1），而其IC10（8 mg·L-1）却显著低于水稻种子（16 mg·L-1）和燕麦种子（14 mg·L-1）。玉米种子的IC50为108.38 mg·L-1，是8 种实验植物品种中最大的；而其IC10（3.81 mg·L-1）却显著低于莴笋（8.36 mg·L-1）和黑麦草（6.28 mg·L-1）（张乙涵等，2014）。这可能与不同品种植物种子自身性状，如，总糖、总蛋白、总脂和灰分，等指标有关（Luo et al.，2019b）。

对比文献研究报道可知，本文青瓜种子的IC50为2.98 mg·L-1，其低于Liu et al.（2009）、张乙涵等（2014）以及Pan et al.（2016）的研究结果，分别为203、10.74 和34.8 mg·L-1，这可能是实验所选青瓜品种不同所致，即种内差异。Luo et al.（2019b）开展了抗生素对植物种内毒性差异的研究，结果表明，TC 对3 种白菜的IC50分别为119.90、24.60 和16.03 mg·L-1，对3 种食用油菜的IC50分别为86.64、55.53 和63.77 mg·L-1，对3 种卷心菜的IC50分别为52.25、15.88 和75.25 mg·L-1。但目前还未见抗生素对青瓜种内毒性差异的研究报道。

同时，本文获得TC 对珠三角常见品种蔬菜的HC5为9.64 μg·L-1，PNEC 为1.93 μg·L-1，这一研究丰富了TC 对蔬菜的毒性数据，为土壤TC 污染的生态风险评估提供科学依据。

4 结论

TC 污染对实验所选品种蔬菜种子萌发指标的影响程度为：根长＞芽长＞发芽率。当TC 质量浓度为10 mg·L-1时，9 种品种蔬菜种子相对根长、相对芽长和发芽率分别为 16.9%—72.5%，42.3%—129.4%，83%—100%。TC 污染对种子萌发的影响程度不仅与测试指标相关，还与蔬菜品种密切相关。当TC 质量浓度为10 mg·L-1时，玉米、青瓜和白瓜种子的相对根长分别为 72.5%、35.9%和16.9%，差异显著。毒性剂量-效应曲线表明，TC 对不同品种蔬菜毒性阈值差异较大，IC50最大值为83.60 mg·L-1（玉米），最小值为2.98 mg·L-1（青瓜）。SSD 曲线表明，不同品种蔬菜对TC 毒性敏感性频次分布顺序为：玉米＞菜心＞芥兰＞豆角＞白菜＞线椒＞花叶芥菜＞白瓜＞青瓜。即，玉米种子对TC 污染的耐受性最强，青瓜种子对TC 最为敏感，可以作为珠三角区域TC 污染生态风险评估的蔬菜品种。本实验获得TC 对不同品种蔬菜的HC5为9.64 μg·L-1，PNEC 为1.93 μg·L-1。