玉米种子芽大小对农杆菌转化的影响

吕孟雨 董福双 柴建芳 周硕 张俊敏 王海波

摘要：以郑58玉米自交系的种子作为试验材料，将玉米种子消毒，发芽后按长度分别将大、小2种玉米芽的生长点进行农杆菌转化，经过共培养后，通过对转化后的再发芽情况和转化芽的绿色荧光蛋白检测，分析玉米芽的大小对转化的影响。结果表明，玉米种子芽长度在0.3～0.5 cm时用于农杆菌转化，有利于农杆菌对玉米芽生长点的侵染转化和转化后芽的再生。

关键词：玉米;芽长;农杆菌;转基因

中图分类号：S513         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）20-0168-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.040           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effect of maize seed bud size on Agrobacterium transformation

LYU Meng-yu，DONG Fu-shuang，CHAI Jian-fang，ZHOU Shuo，ZHANG Jun-min，WANG Hai-bo

（Institute of Genetics and Physiology/Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province，

Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，China）

Abstract： The seeds of Zheng 58 maize inbred lines were used as experimental materials. After the corn seeds were sterilized and germinated， the growth points of big and small maize buds were transformed with Agrobacterium. After co-cultivation， the germination was carried out after transformation. By the situation and the results of green fluorescent protein detection of transformed buds， the effect of the size of maize buds on transformation was analyzed， and the size of maize buds suitable for Agrobacterium transformation was determined. The results showed that the maize seed buds were used for Agrobacterium transformation when they were 0.3～0.5 cm in length， which was beneficial to Agrobacterium tumefaciens infection and transformation of maize buds and post-transformation bud regeneration.

Key words： maize; bud length; Agrobacterium; transgenic

玉米是全球分布最广的粮食作物，也是中国重要的作物[1，2]，转基因玉米作为生物技术产业化重大成果已在世界各地普遍应用，在中国的产业化应用也将是大势所趋，科研工作者应在技术上和管理上都及早准备[3]，深入研究玉米的遗传转化技术具有重要的现实意义。玉米茎尖是近几年遗传转化中广泛应用的一种受体材料，与幼胚及其胚性愈伤组织等受体材料相比，该方法具有简单易行、转化周期短、转化效率高、取材不受季节限制等优点[4]。农杆菌介导法是目前普遍采用的植物遗传转化方法，具有成本低、外源基因拷贝数低、外源基因能稳定遗传表达等特点，更适用于规模化转基因技术体系[1]。1991年Gould等[5]用农杆菌侵染玉米芽尖，得到转基因植株，为建立玉米高效农杆菌介导转化体系奠定了基础。人们对农杆菌转化法进行了多种形式的改进[6-10]，但是利用玉米芽生长点作为受体材料，不经过组织培养直接发育成转化植株，可以减少玉米基因型对转化的影响，是许多方法所不具备的优点。由于玉米芽的大小对茎尖分生组织的分化程度有直接影响，可以影响农杆菌对玉米芽生长点的转化，王楠等[2]利用4～6 cm的玉米芽进行农杆菌转化。但用于玉米芽生长点转化的最佳芽大小尚需进一步研究。本试验通过研究玉米芽大小对转化效果的影响，确定农杆菌对玉米芽生长点进行转化时的适宜玉米芽大小，有利于提高农杆菌对玉米芽生长点的转化效率。

1  材料与方法

1.1  材料

受体材料：利用玉米自交系郑58的成熟种子，以玉米种子发芽后剥出的芽生长点作为转化受体。

所用载体PEGAD（ubi+EGFP）是由河北师范大学提供的含增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的载体PEGAD，将其35S启动子替换为ubiquition启动子改造（图1），所用农杆菌菌株为EHA105，由河北省农林科学院遗传生理研究所实验室提供。

1.2  方法

1.2.1  种子发芽  先用无菌水冲洗玉米种子2次，每次7 min，用0.1%HgCl2消毒13 min， 用无菌水冲洗5遍，每次2 min。將经过消毒清洗的玉米种子放在加有2层滤纸经过高温消毒的培养皿中（直径9 cm），每培养皿放置20粒玉米种子，加8 mL水，加入浓度为2 mg/mL的乙酰丁香酮（AS）56 μL，设置4次重复，在23～25 ℃温度条件下暗培养4～5 d，挑选2种不同大小的种子芽用于转化处理。

1.2.2  活化农杆菌侵染液配制  50 mL LB液体培养基+50 mg/L卡那霉素+40 mg/L利福平+0.1 mL农杆菌菌液，28 ℃、210 r/min振荡培养，当OD600 nm=0.5时，5 ℃、4 000 r/min进行菌液离心5 min，去上清液后加入0.5 mL的GSH侵染基液（高渗侵染基液）+0.1 mmol/L AS+0.1 mg/L普朗尼克F68（转化前30 min进行侵染液準备），配制成农杆菌侵染液。

1.2.3  转化处理培养及检测  根据玉米芽的长度大小设置成2个处理，处理1、处理2芽长分别为0.3～0.5、0.5～1.0 cm，将玉米种子芽剥出生长点，置于加有2层滤纸的培养皿中，每只培养皿放置8～9粒玉米种子，在-18 ℃条件下处理20 min，开盖风干30～50 min，滴加2 μL农杆菌侵染液，再风干50～55 min，每培养皿加1.5 mL无菌水，加盖后封口，在23～25 ℃条件下暗培养3 d，光照培养4 d后调查发芽情况和检测荧光蛋白。将转化的玉米种子芽移栽到蛭石中，继续进行光照培养。

2  结果与分析

2.1  转化后的发芽情况

转化后玉米发芽情况如表1所示，处理1的发芽率比处理2的发芽率高24个百分点，与处理2相比，处理1再生的芽更长（图2），表明利用较小的玉米芽进行农杆菌转化，在生长点被转化后更容易再长出芽发育成玉米植株，表现出较强的分化再生能力。即用较小的芽转化，转化后的发芽率更高，有利于获得较多的植株。

2.2  玉米芽大小对转化效果的影响

对转化后玉米芽的绿色荧光蛋白进行检测，从绿色荧光蛋白的表达强度（图3）来看，两种处理的差异不大，表明转化芽中阳性细胞的嵌合程度差异不大，农杆菌转化种子芽生长点0.3～1.0 cm，受体材料对农杆菌的转化程度没有差异，但在此基础上由于处理1转化后能够得到的玉米芽更多，获得的阳性芽率较处理2提高16个百分点，表明利用较小的玉米芽转化更有利于获得转基因植株。

3  小结

除玉米芽的大小外，在其他转化条件相同的情况下，利用长度为0.3～0.5 cm的玉米芽生长点作为转化受体进行农杆菌转化，不仅有利于转化后玉米芽的再生，还不影响农杆菌的转化效果，在转化相同数量受体的情况下可以获得更多的转化植株，是较理想的玉米芽生长点转化受体材料。

参考文献：

[1] 刘允军，贾志伟，刘  艳，等.玉米规模化转基因技术体系构建及其应用[J].中国农业科学，2014，47（21）：4172-4182.

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[5] GOULD J，DEVEY M，HASEGAWA O，et al. Transformation of Zea mays L. using Agrobacterium tumefaciens and the shoot apex[J].Plant physiology，1991，95：426-434.

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