毛竹对铀胁迫的生理响应与富集特性研究

苟志坤 陈 鹏 徐 刚 樊 伟 龚小强 曹 颖 胡尚连

（西南科技大学生命科学与工程学院，植物细胞工程实验室/四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川 绵阳 621010）

在铀尾矿治理过程中会产生大量难以处理的铀废水［1］。铀废水排放或流失到环境中会通过食物链进入人体，从而对人体健康产生严重危害［2-3］。处理铀废水的方法有化学法、物理法和生物法，其中生物法中的植物修复技术因成本低、操作方便、不易造成二次污染等优点而成为近年来的研究热点［4-5］。目前，利用植物修复技术能够将水体中的重金属元素富集到植物地上部分，再通过收割地上部分进行处理，在一定程度上能够达到减少或去除废水中重金属污染的效果［6-7］。Liu等［8］通过水培试验研究了毛竹幼苗对铅的积累和耐性，结果表明当铅浓度达到400 mg·L-1时，毛竹幼苗生长受到明显抑制，根、茎、叶中吸收铅浓度分别为4 282.8、482.2和148.8 mg·kg-1。李松［9］研究水培条件下重金属胁迫对毛竹幼苗生长的影响，结果表明铅和锌浓度分别为10～200和10～100 mg·L-1时，毛竹表现出较强的抗逆性，其植株生长茂盛；在受到重金属铅、锌、铜污染水体的影响下，毛竹生物量随着重金属浓度的增加呈先上升后下降趋势，在镉污染下，毛竹生物量则呈下降趋势。但目前有关毛竹应用于含铀废水治理中的相关报道较少。因此，本研究以毛竹为研究对象，采用水培试验研究不同浓度铀胁迫对毛竹生理生化指标及铀富集特性的影响，旨在为植物应用于铀废水污染水体修复提供一定的实践参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

毛竹幼苗购自四川省眉山市，为一年生实生苗，株高12 cm，3～4 片真叶。试验地点位于西南科技大学校内试验基地智能温室，时间为2022年夏季，温室平均温度24.7～27.3 ℃，相对湿度50%～60%。

1.2 水培试验设计

选择生长良好、长势一致的毛竹幼苗，用离子水清洗后，将其移入装有1/4 Hoagland’s 改良营养液［10］的黑色塑料小桶中（桶的规格为2 L），培养3 d 后对毛竹幼苗进行不同浓度铀处理。将不同重量且稳定的乙酸双氧铀［UO2（CH3COO）2·2H2O］加入1/4 Hoagland’s 改良营养液（mg·L-1）［10］，配置不同浓度铀处理溶液，乙酸双氧铀浓度分别为0、10、25、50、100、200、400 mg·L-1，分别记为CK、U10、U25、U50、U100、U200、U400，每个处理3 次生物学重复，每桶6 株，每隔3 d 更换一次溶液，处理30 d 后收获植株，并根据Wang 等［11］的方法进行取样，其中每个处理取4 株，然后把根、茎、叶分开，根据不同测定指标进行样品制备。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 光合参数测定 采用Li-6400 便携式光合测定仪（美国Li-COR 公司）直接测定毛竹叶片的光合参数。选取从上到下第3 片完全展开的成熟叶片，于上午9∶00—11∶00 光照强度800 µmol·m-2·s-1、叶室温度24 ℃的条件下，测定毛竹叶片气体交换参数，包括净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、蒸腾速率（transpiration rate，Tr）、气孔导度（stomatic conductance，Gs）和胞间CO2浓度（intercellular CO2concentration，Ci），每个样本5次生物学重复。

1.3.2 叶绿素含量测定 参照《现代植物生理学》［12］的方法，称取毛竹叶片0.1 g 用于提取叶绿素含量，使用U-3900 紫外分光光度计（日本日立公司）测定663和645 nm 处的吸光值A663和A645，3 次重复。按下列公式计算叶绿素a（chlorophyll a，Chl a）和叶绿素b（chlorophyll b，Chl b）含量［13］：

Chl a=12.21A663-2.81A645；

Chl b=20.13A645-5.03A663。

1.3.3 生长指标的测定 取不同浓度铀处理的毛竹幼苗，用10 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetra acetate，EDTA-2Na）溶液浸泡15 min，洗去附着在植株根系表面的重金属，再用蒸馏水冲洗，吸干表面水分。然后分别对每个处理的单株根、茎、叶部位称量鲜重，装入信封袋中，于105 ℃烘箱中杀青30 min，75 ℃干燥至恒重，再称取根、茎、叶的干重［14］。

1.3.4 抗氧化酶活性的测定 称取0.1 g叶片样本加入1 mL酶活提取液，冰浴中研磨成匀浆，在8 000 r·min-1下离心10 min，取0.2 mL 上清液用于酶活测定。选用北京索莱宝科技有限公司的抗氧化酶系列试剂盒分别测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，每个处理5个生物学重复。

1.3.5 铀含量分析 使用FW135 中草药粉碎机（北京永光明医疗仪器有限公司）将烘干后的样品材料根茎叶分别粉碎，称取0.1 g，加入3 mL硝酸和1 mL盐酸的混合液，在Synthos 3000 微波消解仪（奥地利安东帕公司）中消解样本，每个部位重复消解3 次，稀硝酸定容至50 mL后，经0.45 µm滤膜过滤到10 mL的塑料离心管中；使用7700x ICP-MS 电感耦合等离子体质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）测定铀含量，并按以下公式计算铀的生物转移系数（transferfactor，TF）和富集系数（bioconcentrationfactor，BCF）：

BCF=植物中重金属浓度÷水体重金属浓度；

TF=植物地上部重金属浓度÷植物地下部重金属浓度。

1.4 数据处理

使用SPSS 26 软件对所有数据进行单因素方差分析，从而确定各处理组之间的差异，应用Origin 2022软件绘图。

2 结果与分析

2.1 铀胁迫下毛竹生长状况

生物量是揭示植物对逆境胁迫响应的常用指标。由图1可知，随着铀浓度的增加，毛竹幼苗鲜重和干重呈先升高后降低的趋势。其中50 mg·L-1铀胁迫对毛竹生物量促进最明显，该浓度下，毛竹地上部鲜重和干重分别比对照组提高了6.74%和12.08%，地下部鲜重和干重分别比对照组提高了7.82%和7.01%。200～400 mg·L-1铀胁迫对毛竹生物量具有抑制作用，在400 mg·L-1铀浓度下，毛竹地上和地下部鲜重及干重均较对照显著降低，该浓度铀胁迫对毛竹生长抑制程度最显著。

图1 不同浓度铀胁迫下毛竹鲜重（A）和干重（B）的变化Fig.1 Changes in fresh weight（A）and dry weight（B）of moso bamboo biomass under different concentrations of uranium stress

2.2 铀胁迫下毛竹气体交换参数

由图2可知，毛竹叶片的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）均随着铀浓度的增加呈现出先升高后降低的趋势。Pn、Tr 和Gs 在50 mg·L-1铀浓度处理下达到最大值，并高于对照组，其中Tr 与其他处理组之间差异显著。在400 mg·L-1铀浓度时，Tr、Pn、Gs 分别较对照降低了18.81%、39.71%和36.25%，以Pn 下降幅度较大。胞间CO2浓度（Ci）随着铀浓度的增加而降低，处理间均无显著差异。

图2 不同铀浓度下毛竹叶片净光合速率（A）、蒸腾速率（B）、气孔导度（C）和胞间CO2浓度（D）参数的变化Fig.2 Changes in parameters of net photosynthetic rate（A），transpiration rate（B），stomatal conductance（C）and intercellular CO2 concentration（D）of moso bamboo leaves at different uranium concentrations

2.3 铀胁迫下毛竹叶绿素含量

叶绿素含量通常可以反映植物的生长情况，同时也能够反映植物光合作用的强弱。由图3 可知，随着铀浓度的增加，毛竹幼苗叶片叶绿素a、b 及叶绿素总含量整体呈降低的趋势。当铀浓度为25 mg·L-1时，叶绿素a、b 及叶绿素总含量较对照组无显著差异；当铀浓度为100～200 mg·L-1时则显著低于对照组；当铀浓度为400 mg·L-1时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量和Chl a/Chl b分别较对照组显著下降42.02%、32.69%、35.21%和25.00%，叶绿素a 含量下降幅度大于叶绿素b含量下降幅度，说明铀对毛竹叶绿素a的抑制作用明显大于叶绿素b。

图3 不同铀浓度胁迫下对毛竹叶绿素a含量（A）、叶绿素b含量（B）、叶绿素（a+b）含量（C）和叶绿素a/b（D）变化的影响Fig.3 Effects of different uranium concentration stress on the changes of chlorophyll a content（A），chlorophyll b content（B），chlorophyll（a+b）content（C）and chlorophyll a/b（D）in moso bamboo

2.4 铀胁迫对毛竹抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

当植物遭受逆境胁迫时，其抗氧化物酶起到了关键性的调控作用。在不同浓度铀胁迫下，毛竹的抗氧化酶活性和MDA含量测定结果见图4。各浓度铀处理下，SOD、POD、CAT 和APX 活性均呈现出低浓度促进、高浓度抑制的变化趋势，且在铀浓度为50 mg·L-1时达到最大值，分别较对照组增加了33.02%、38.75%、27.36%和22.25%；当浓度大于100 mg·L-1后，随着浓度的增加，毛竹叶片四种抗氧化酶活性逐渐降低，在400 mg·L-1浓度下分别较对照下降了33.02%、38.75%、27.36%和22.25%。MDA 含量随着铀浓度的增加而逐渐增加，且在铀浓度为100～400 mg·L-1处理下差异显著（P＜0.05），以400 mg·L-1铀浓度胁迫下的MDA 含量最高，较对照组增加40.78%。

图4 不同铀浓度胁迫下毛竹的SOD（A）、POD（B）、CAT（C）、APX活性（D）和MDA含量（E）变化Fig.4 Changes in SOD（A），POD（B），CAT（C），APX activity（D）and MDA content（E）of moso bamboo under different uranium concentration stresses

2.5 铀在毛竹幼苗体内的累积、分布和迁移特性

评价植物富集重金属能力的重要指标是植物体各器官所吸收重金属的含量。由表1 可知，毛竹幼苗对铀具有一定的富集能力，随着培养基中铀浓度的增加，毛竹植株各器官的铀富集浓度均表现为根＞茎＞叶。当铀浓度为400 mg·L-1时，毛竹根、茎、叶铀富集浓度别为9 089、519和276 mg·kg-1。BCF 和TF 分别用于评价植物对铀的积累和转移作用，在不同铀浓度处理下，毛竹富集系数均表现为根/茎＞茎/茎＞叶/茎，转移系数表现为叶/根＞茎/根。当铀浓度为10 mg·L-1时，毛竹总富集系数达到最大值，为10.838；总转移系数在铀浓度为50 mg·L-1时达到最大值，为0.238。说明在上述两个浓度下，毛竹吸收和转移铀的能力较强。

表1 不同浓度铀处理毛竹30 d时铀的富集与分布情况Table 1 Uranium enrichment and distribution in moso bamboo treated for 30 days with various enriched uranium sources

2.6 铀胁迫下毛竹生理指标和富集系数、转移系数的相关性

不同浓度铀胁迫下毛竹生理指标和富集系数、转移系数的相关性分析结果表明（表2），Pn 和Tr、Ci呈显著或极显著正相关，Tr与Ci呈极显著正相关，Ci与MDA、Chl a、Chl b含量和TF呈显著正相关，SOD活性和POD、CAT、APX 活性呈显著或极显著正相关，POD 活性与APX活性呈极显著正相关，CAT活性和APX活性、MDA含量呈显著或极显著正相关，APX 活性和Chl a含量呈显著正相关，MDA 与Chl a 含量呈极显著正相关，BCF和TF呈极显著正相关。

表2 铀胁迫下毛竹生理指标和富集系数、转移系数的相关性分析Table 2 Analysis of the relationships between uranium-stressed moso bamboo’s enrichment and transfer coefficients and physiological markers

3 讨论

重金属污染土壤会严重影响植物生长，当浓度超过临界值时，会出现植株生长状况不良、叶片褪绿变黄及叶片枯萎、生物量明显减少及植株死亡等毒害症状［14-16］。植物遭受重金属毒害症状最直观的表现是生物量，同时生物量也是评估植物抗逆能力的重要指标。本研究中，毛竹生物量（鲜重和干重）随着铀浓度的增加呈现先增加后降低趋势，低浓度（10～50 mg·L-1）铀胁迫对毛竹幼苗生物量有促进作用。当铀浓度大于50 mg·L-1时，随着铀浓度的升高，毛竹鲜重和干重呈显著下降趋势，铀对地上部的抑制作用大于地下部，这与赵奇等［17］的研究结果类似。

植物在遭受胁迫时，光合速率会受到气孔限制和非气孔限制两方面影响［18］。有研究表明，当Pn 下降时，若植物Ci 和Gs 反而升高，说明叶片光合速率降低的主要限制因素是非气孔因素，即叶肉细胞光合活性的下降；当Pn 下降时，若植物Ci 和Gs 同样下降，说明气孔是限制叶片光合速率的主要因素［19-20］。本研究发现，当铀浓度为50 mg·L-1时，毛竹气孔导度和蒸腾速率达到最大，这有利于植物维持自身正常的叶温，同时也利于植物营养物质的运输，对于促进植物生长起到很大的作用［14］。在高浓度铀（100～400 mg·L-1）处理时，毛竹净光合速率、气孔导度和蒸腾速率较对照明显降低，胞间CO2浓度变化不显著，说明净光合速率下降的内在原因主要是受非气孔因素影响，即叶肉细胞光合活性的下降［21］；同时高浓度铀处理造成毛竹膜脂过氧化、细胞损伤，光合作用受到抑制［14］。

当植物遭受重金属胁迫时会产生大量的自由基［22］，这些自由基将会严重造成植物生长缓慢、抑制正常的代谢活动。因此，植物本身将会启动一系列抗氧化酶系统来减少自由基，以保证其正常生长，其中起主要作用的是SOD、POD 和CAT［23］。本研究发现，重金属对植物的抗氧化酶系统产生了影响，但植物的SOD、POD和CAT 活性均随铀浓度的增加呈现出先升高后降低的趋势，这表明植物具有一定的抗逆能力，但其保护作用有一定限度［14，24］。同时，SOD、POD、CAT、APX 活性均在铀浓度为50 mg·L-1处理下达到最大值，表明该浓度下毛竹体内抗氧化酶系统的响应最为积极，能够有效清除植株体内过量的活性氧物质。在最高浓度（400 mg·L-1）处理下抗氧化酶活性较对照显著下降，可能是由于植物体内防御系统对活性氧的清除能力减弱，已不能阻止自由基在植物细胞内的累积，导致细胞膜脂过氧化，引起细胞的衰老和死亡，最终使抗氧化酶活性下降。丙二醛是植物细胞发生膜脂过氧化后的最终产物，从而用来衡量植物受胁迫程度［14，25］。随着铀浓度的升高，毛竹的MDA 含量逐渐升高，说明在高浓度铀胁迫下植物产生了大量活性氧，抗氧化酶系统无法清除大量的活性氧，从而造成严重的膜脂过氧化，对细胞膜系统造成损伤。

重金属对植物的毒害作用主要表现在植物对重金属的吸收和运输上，与重金属在植物不同器官之间的分配，以及植物体内重金属的结合形态等因素有关［26］。植物吸收铀的主要器官是根系，并逐渐向茎、叶等器官转移［27］。Ding 等［28］对铬胁迫下红麻体内铬含量的研究及陈小米等［29］对镉和锌复合污染条件下竹柳重金属含量的研究结果均显示，植物体内重金属含量随着环境重金属浓度的增加而增加。本研究同样发现，在铀浓度为400 mg·L-1时，毛竹根、茎、叶的铀富集浓度分别为9 089、519 和276 mg·kg-1，由此可见，根部对铀的积累量远大于茎和叶部。有关毛竹对铀的转运机制还有待深入研究。

本研究结果表明，Pn 和Tr、Ci 呈显著或极显著正相关，Tr 与Ci 呈极显著正相关，Ci 与MDA、Chl a、Chl b含量和TF 呈显著或极显著正相关，SOD 活性和POD、CAT、APX活性呈显著正相关，POD活性与APX活性呈显著或极显著正相关，CAT 活性和APX 活性、MDA 含量呈显著或极显著正相关，APX 活性和Chl a含量呈显著正相关，MDA 与Chl a 含量呈极显著正相关，BCF 和TF 呈极显著正相关。随着铀浓度的增大，光合作用受到了明显抑制，胞间二氧化碳浓度对气孔导度的影响不大，抗氧化酶活性不断增大，以此来抵抗逆境，表明毛竹具有较强的耐受性，从而导致丙二醛含量逐渐增加，引起细胞内离子平衡失调，代谢紊乱，生长受到抑制。这与王一峰等［30］有关铅胁迫对污染区与非污染区乌苏里风毛菊MDA 含量影响的结果相似。从富集系数和转移系数来看，随着铀浓度的增加，二者整体呈下降趋势，其中在10 和50 mg·L-1处理时，毛竹吸收和转移铀的能力最强，这是因为低浓度胁迫下，水体中的铀含量基数相对较小，更有利于植物吸收和转移铀。在高浓度铀处理下，BCF和TF整体呈下降趋势，说明毛竹对铀的富集和转移能力相对较高，从而导致了植物向地上部分富集和转移重金属的能力减弱［31-32］。有研究表明，富集系数与转移系数可以很好地反映植物对重金属的富集和转移能力［33］。富集系数和转移系数均大于1的植物为超富集植物，二者均小于1则为富集植物，后续需进一步研究如何使植物地上部从地下部吸收较多的铀，进一步证明毛竹对铀污染水体具有潜在的修复能力。

4 结论

本研究结果表明，在乙酸双氧铀浓度为10～50 mg·L-1时，SOD、POD、CAT 和APX 活性随铀浓度的增加而上升，可以缓解铀对毛竹造成的氧化损伤，对毛竹生长发育无明显影响；而在400 mg·L-1高浓度铀胁迫下，毛竹幼苗体内抗氧化酶活性降低，膜系统受到破坏，导致毛竹细胞受到严重伤害，对毛竹生长发育具有抑制作用。当铀浓度为400 mg L-1时，毛竹根、茎、叶对铀的积累量达到最大值，根部富集量明显大于地上部，且向茎叶转移铀的能力较弱。综上，毛竹并非理想的铀超富集植物，但其较强的耐受力和根部较强的富集能力使其有望成为铀污染水体治理的潜在植物之一。