四种类型竹种竹叶总RNA提取方法的比较研究

马迎春 王曙光，2，3 詹 卉，2 于丽霞，2 杨德佳 高若天 李 娟，2，*

（1西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2西南林业大学云南省丛生竹重点实验室，云南 昆明 650224；3西南林业大学竹藤科学研究院，云南 昆明 650224）

竹类植物隶属于单子叶植物纲（Monocotyledoneae）禾本目（Graminales）禾本科（Gramineae 或Poaceae）竹亚科（Bambusoidese）［1］，自然分布于年降雨量1 200～4 000 mm、年平均温度8～36 ℃的地区［2］。我国现有竹类植物40 属500 余种，其中云南分布的竹类植物有29 属220余种，且特有种在100种以上［3］。

竹亚科植物地下茎形态较特殊，是竹种分类的重要依据之一。按地下茎形态可将竹类植物分为合轴型（sympodium）、单轴型（monopodium）和复轴型（amphipodium）三大类，合轴型竹种进一步分为合轴丛生亚型和合轴散生亚型［1］。合轴丛生亚型主要有牡竹属（Dendrocalamus）、慈竹属（Neosinocalamus）等竹种。勃氏甜龙竹（D.brandisii）为牡竹属乔木状竹种，是云南省重点发展的笋用竹种；合轴散生亚型竹种的代表为箭竹属（Fargesia）竹种［4］，云南箭竹（F.yunnanensis）为箭竹属竹种，主要分布于云南省，具有很高的观赏价值和食用价值。单轴型代表竹种为刚竹属（Phyllostachys）的毛竹（Ph.edulis），毛竹是我国重要的森林资源，也是中国分布最广的竹种［5］。复轴混生型代表竹种为巴山木竹属（Bashania），该属代表竹种为巴山木竹（B.fargesii），多为熊猫食用竹［6］，其竹林可作为熊猫的栖息地［7］。

我国竹类资源丰富，是森林资源及园林绿化中不可缺少的部分。前期的竹类植物研究主要集中在糖分代谢［8-9］、组织结构［10］、竹种分类［11］、生长繁殖［12］、生理生化［13-14］等方面，涉及分子生物学层面的研究较少。目前，毛竹（Ph.edulis）、麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）等已有转录组测序等分子层面的研究［15-17］，其研究主要采用RNA 试剂盒提取所需的RNA，但未考虑试剂盒的普适性。多数竹子的纤维素含量高且富含酚类物质、蛋白质、多糖等代谢产物［18-19］，且多糖、酚类物质易与RNA结合［20-21］，影响核酸的提取质量。如何提取高品质的竹类植物RNA，且兼顾提取效率和成本等因素，是目前竹类植物分子生物学研究领域急需解决的难题。

竹类植物种类较多，形态差异大，不同类型竹种的代谢产物也各有不同，寻找适合所有竹种的RNA 提取方法仍较难实现。鉴于此，本研究选择不同地下茎形态的代表竹种——勃氏甜龙竹、云南箭竹、毛竹、巴山木竹心叶为试验材料；采用隶属函数对自配TRIzol 试剂法、商品化TRIzon 试剂法、RNA 试剂盒法、改良十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法四种方法提取的竹叶总RNA 进行提取质量、纯度、成本等方面的综合比较，以期筛选经济、便捷、高质量的竹叶RNA 提取方法，为后续竹类植物的分子生物学研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1 试验材料 试验所用勃氏甜龙竹、云南箭竹、毛竹、巴山木竹竹叶均于2023年3月中旬采自位于云南省昆明市的西南林业大学校内（25°06'N，102°78'E），为减少木质素和纤维素等成分的干扰，所取用的竹子幼嫩叶片均为中脉部针叶（心叶），叶片尚未发育展开，取样后迅速置于液氮中备用。取样部位见图1。

图1 不同竹种竹叶材料提取部位Fig.1 Extraction parts of bamboo leaves from different bamboo species

1.1.2 试验试剂 自配TRIzol 试剂：硫氰酸铵0.4 mol·L-1、异硫氰酸胍0.8 mol·L-1、三水乙酸钠0.1 mol·L-1、甘油5%、乙酸0.73%、苯酚38%，4 ℃避光保存、2% CTAB（5 g、NaCl 20.2 g、1 mol·L-1Tris-HCl 25 mL、0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）10 mL，加超纯水至250 mL。商品化TRIzon 试剂（TRIzon 总RNA 提取试剂）及全能型植物RNA 提取试剂盒（DNase I）均购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司（货号及价格见表1）。其他试剂有无水乙醇（分析纯）、氯仿（分析纯）、异戊醇（分析纯）、异丙醇（分析纯）、70%、95%及75%酒精、双蒸水（ddH2O）、β-疏基乙醇（2-mercaptoethanol）、10%氯化锂（LiCl）溶液、焦碳酸二乙脂（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水、TAE（tris acetate EDTA，TAE）缓冲液、无核酸酶水（RNase-free water）等。

表1 四种提取方法主要试剂货号及价格Table 1 Number and price of main reagents in four extraction methods

1.2 仪器与设备

CF16RXⅡ落地式高速冷冻离心机（Hitachi Koki，日本）、NanoDrop2000 超微量分光光度计（Thermo Fisher，美国）、MX-E 固定式旋转混匀仪［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司］、SS-325 高压蒸汽灭菌锅（Tomy，日本）、SQP 分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、SW-CJ-1FD 超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、EU-K1-TJ30 实验室超纯水机（南京欧铠环境科技有限公司）、IMS-50 制冰机（常熟市雪科电器有限公司）、DYY-4C 电泳仪（北京市六一仪器厂）、Universal Hood Ⅱ 凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）、LG100B理化干燥箱（上海市实验仪器总厂）。

1.3 试验方法

自配TRIzol 试剂法、商品化TRIzon 试剂法操作步骤相同，具体步骤参考孙国胜等［22］的方法；改良CTAB法相比于传统CTAB法是在配置过程中加入β-硫基乙醇，目的是防止多酚氧化，消除在细胞裂解时释放的核糖核酸酶，具体操作步骤参考孙国胜等［22］的方法；RNA 提取试剂盒法按照全能型植物RNA 提取试剂盒（DNase I）说明书进行操作。

RNA 提取过程中所用到的研钵、剪刀、镊子等非一次性器材及工具，均用DEPC 水过夜浸泡处理，高压灭菌、烘干后使用；离心管、枪头等均为RNase-free 材料；RNA的溶解、稀释以及乙醇的稀释，均使用RNasefree超纯水。

1.3.1 RNA纯度及浓度检测 通过使用NanoDrop2000超微量分光光度计对自配TRIzol试剂法、商品化TRIzon试剂法、RNA 提取试剂盒法以及改良CTAB 法四种方法提取得到的竹叶总RNA 浓度和纯度进行检测（检测前用DEPC水为空白对照调零仪器），并记录各RNA样品的浓度及OD260/OD280、OD260/OD230的比值。

1.3.2 RNA完整性检测 取提取的RNA样品5 µL，与1 µL 5×RNA Loading Buffer混匀后，在100～120 V电压条件下，经1%的琼脂糖凝胶电泳30 min。电泳结束后，经Bio-Rad凝胶成像系统检查RNA电泳条带的完整性。

1.4 数据处理及分析

隶属函数是对多种指标进行综合评价的一种方法，目前被广泛应用在植物领域的相关研究中［23-24］。应用隶属函数法对RNA 的质量进行评价是一种较为科学的方法［25］。

采用SPSS 26 软件对数据进行差异性及隶属函数分析；采用Excel 2016 软件对数据进行汇总、分组及隶属函数值计算［26］处理；采用Origin 2021 对分析结果进行绘图。

按照公式计算不同提取方法各项综合指标的隶属函数值：

μ(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)i=1，2，3，…，n

式中，Xi表示第i个综合指标；Xmax表示第i个综合指标中的最大值；Xmin表示第i个综合指标中的最小值。

各综合指标的权重：

式中，Wi表示第i个综合指标在所有综合指标中的权重；Pi表示不同提取方法第i个综合指标的贡献率。

不同提取方法的综合优劣评价值：

式中，D值为不同提取方法由各项综合指标评价所得的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法提取的竹叶总RNA纯度及浓度分析

2.1.1 总RNA 纯度分析 RNA 的OD 值是衡量RNA纯度高低的一个重要指标，较为理想的总RNA 的OD260/OD280 比值应为1.8～2.1［27］，当OD260/OD280的值小于1.8时，说明RNA中存在较多的污染，这种污染可能是蛋白质或者其他杂质。当OD260/OD280的值大于2.2时，说明RNA已部分降解［28］。OD260/OD230的值作为参考，一般大于2.0 较好。若OD260/OD230 的值低于2.0，则说明提取的RNA有污染［29］，这种污染一般来自蛋白质、盐类或次生代谢物。

由表2 可知，使用自配TRIzol 试剂法提取的四种样品总RNA中，除毛竹竹叶的RNA存在少量杂质的污染外，其他三种竹叶的OD260/OD280、OD260/OD230都为1.8～2.1，且RNA 浓度均高于220 ng·µL-1。商品化TRIzon 试剂法提取的总RNA 的OD260/OD280 同样为1.8～2.1，浓度高于200 ng·µL-1，但OD260/OD230较低，说明该方法提取的总RNA 存在着较多的盐类、蛋白质等杂质的污染。RNA 提取试剂盒提取的总RNA的OD260/OD280 和OD260/OD230 均较低，浓度偏低，表明RNA存在严重的污染，且降解严重。改良CTAB法提取的总RNA 的OD260/OD280 和OD260/OD230 略高于RNA提取试剂盒，但浓度低于RNA提取试剂盒。

表2 四种方法提取的竹叶总RNA纯度和浓度对比Table 2 Comparison of purity and concentration of total RNA extracted from bamboo leaves by four different methods

综上，在RNA 的纯度上，四种提取方法高低排序依次为：自配TRIzol 试剂法＞商品化TRIzon 试剂法＞改良CTAB法＞RNA提取试剂盒法。

2.1.2 总RNA 浓度分析 RNA 的浓度是衡量所提取的RNA 质量高低的重要标准，若RNA 的浓度较低，则影响后续分子生物学试验。对不同提取方法得到的RNA浓度进行差异性分析并绘图，结果如图2所示，自配TRIzol 试剂法、商品化TRIzon 试剂法得到的总RNA浓度均大于200 ng·µL-1，且显著高于试剂盒法、改良CTAB 法。除毛竹叶片采用商品化TRIzon 试剂法提取得到的总RNA 浓度高于自配TRIzol 试剂提取法外，自配TRIzol 试剂提取法提取的总RNA 浓度最高，与其他三种方法所得到的总RNA 浓度均有极显著性差异，说明该方法及商品化TRIzon 试剂法提取的总RNA 浓度较高，提取效果好。而改良CTAB 法及RNA 提取试剂盒法提取的总RNA 浓度均低于150 ng·µL-1，且显著低于自配TRIzol 试剂法、商品化TRIzon 试剂法，表明改良CTAB 法及RNA 提取试剂盒法不适合用于竹叶RNA的提取。

图2 四种提取方法提取的RNA浓度差异比较Fig.2 Comparison of RNA concentrations extracted by four extraction methods

综合四种方法提取的总RNA 的质量及浓度，自配TRIzol试剂法、商品化TRIzon试剂法所提取的总RNA，在质量和浓度上，均优于RNA 提取试剂盒法及改良CTAB 法，并且自配TRIzol 试剂法优于商品化TRIzon试剂法。综上，自配TRIzol 试剂法为提取不同类型竹叶RNA的最优方法。

2.2 不同提取方法提取的竹叶总RNA完整性分析

琼脂糖凝胶电泳条带的质量是评估提取的总RNA完整性最快捷的方法，一般电泳条带的亮度与提取的RNA 浓度成正比。对于真核生物样品，完整的总RNA 在进行变性凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带，两条带的亮度比约为2∶1，并且可以观察到5S rRNA条带。

经过电泳，自配TRIzol 试剂法与商品化TRIzon 试剂法提取的总RNA 条带如图3所示，自配TRIzol 试剂法提取的总RNA 电泳条带清晰（图3-A），28S 和18S rRNA 条带亮度比接近2∶1，勃氏甜龙竹（D.brandisii）的两条5S rRNA 条带较亮（图3-A、C），表明存在一定的蛋白质污染，其他竹种RNA 条带无拖尾、弥散，表明自配TRIzol 试剂法提取的竹子叶片的总RNA 质量较高；商品化TRIzon试剂法提取的总RNA 电泳条带较清晰（图3-B），可以观察到28S、18S和5S rRNA条带，其条带亮度稍弱于自配TRIzol 试剂法，表明商品化TRIzon试剂法提取的总RNA 浓度低于自配TRIzol 试剂法，该方法提取的总RNA条带仅一条云南箭竹（F.yunnanensis）出现拖尾现象（图3-B），说明该方法提取的竹叶的RNA质量总体较高。

图3 四种提取法提取的竹叶总RNA电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of total RNA extracted from bamboo leaves by four extraction methods

RNA试剂盒法提取的总RNA电泳条带（图3-C）较清晰，其中勃氏甜龙竹（D.brandisii）及云南箭竹（F.yunnanensis）叶片提取的总RNA 电泳条带较亮表明提取浓度较高，但5S rRNA 条带亮度较高（图3-C），表明存在蛋白质污染，其他两种竹叶总RNA 电泳条带较浅，且毛竹（Ph.edulis）的RNA 电泳条带存在弥散现象（图3-C），表明RNA 试剂盒法提取的这两种竹叶总RNA浓度较低且有降解。

改良CTAB 法提取的竹叶总RNA 电泳条带中（图3-D），勃氏甜龙竹（D.brandisii）叶片的 RNA 电泳条带存在严重的拖尾、弥散现象，说明该RNA样品存在大量的降解、污染，云南箭竹（F.yunnanensis）、巴山木竹（B.fargesii）竹叶RNA 电泳条带较清晰但有少量拖尾，而毛竹（Ph.edulis）叶片的总RNA 电泳条带亮度很浅几乎不可见，表明该方法基本没有提取出毛竹的RNA。

综上，四种方法大部分都可以提取出RNA，但浓度差异较大，提取的纯度也各有不同。综合不同提取方法提取的总RNA 的质量、浓度及电泳条带的完整性，四种方法的优劣性从高到低依次是：自配TRIzol试剂法＞商品化TRIzon试剂法＞RNA提取试剂盒法＞改良CTAB提取法。

2.3 不同提取方法的成本及优缺点分析

综合比较四种提取方法操作的难易程度、耗时长短、成本及RNA的完整性和浓度，结果如表3所示。自配的TRIzol试剂、商品化TRIzon 试剂以及RNA 提取试剂盒，三种方法提取步骤简便，操作简单，耗时较短均在2 h 内；而改良的CTAB 法的耗时15 h，提取时间长，效率低。价格上（表1）自配TRIzol 试剂成本约为0.2 元/样，远低于TRIzon 试剂（约4.03 元/样）和植物RNA 提取试剂盒的提取成本的成本（约16元/样），改良CTAB法虽成本较低（约0.26元/样）。四种提取方法中，自配的TRIzol试剂、商品化TRIzon 试剂提取的总RNA 质量显著优于RNA 提取试剂盒法及改良的CTAB 法（表3），并且自配的TRIzol试剂法提取的总RNA质量要优于商品化TRIzon试剂法（图2）。综上，实验室自配的TRIzol试剂最佳。

表3 不同提取方法综合比较分析Table 3 Comprehensive comparative analysis of different extraction methods

2.4 采用隶属函数对不同提取方法进行综合评价

隶属函数分析中，D值越接近于1，表明该方法综合评分越高，其提取效果越好［30］。通过分析比较，自配TRIzol试剂法的D值为0.846，最接近于1；其次是商品化TRIzon试剂法，D值为0.754；RNA提取试剂盒法和改良CTAB法的D值均较低，分别为0.343和0.145（表4）。因此，四种提取方法优劣顺序为自配Trizol 试剂法＞商品化TRIzon试剂法＞RNA提取试剂盒法＞改良CTAB法。

表4 不同提取方法隶属函数分析Table 4 Membership function analysis of different extraction methods

3 讨论

3.1 不同提取方法的适用性

不同的植物因其组织成分、内含代谢物质等的不同，适用的RNA提取方法也有很大的差别。RNA试剂盒法在RNA提取中较为常用，适用于鸢尾属植物［31］、葡萄［32］等植物的RNA提取。本研究采用RNA试剂盒提取四种竹叶的RNA，提取的RNA 降解严重，并且浓度较低，且该方法提取成本较高，因此不适用于竹叶RNA提取。

CTAB 法最初被应用在松树组织的RNA 提取试验中［33］，目前较为广泛地被用于多糖和多酚类植物组织的RNA提取［34-36］。改良的CTAB法是在原有的CTAB法基础上加入适量的β-疏基乙醇和LiCl，用来抑制RNase 活性和沉淀RNA，有助于提高RNA 的提取效率。在其他竹类植物［37-38］的RNA 提取试验中，同样采用CTAB 法进行RNA 提取，但提取效果较差。在本研究中，该方法提取的RNA 完整性和浓度都较差，且提取RNA时步骤繁琐，耗时较长，容易导致RNA降解，证实了改良CTAB法不适宜于竹叶RNA提取。

TRIzol 与三氯甲烷、水饱和酚（酸性）、异丙醇等试剂搭配使用，在植物RNA 提取过程中也较为常用［39］。在毛竹不同组织的RNA 提取中［40］，TRIzol 法提取效果较好。本研究中使用的商品化TRIzon 试剂和自配TRIzol 试剂法两种方法对不同竹种竹叶进行RNA 提取，结果发现，两种方法均可以从竹叶中提取到浓度较高的RNA，且完整性较好、电泳条带清晰明亮；两种方法耗时均较短，在一定程度上降低了RNA 的降解程度，从而保证RNA 的完整性，进一步说明TRIzol 法在不同竹种竹叶的RNA提取中，适用性高。

在上述结果基础上，本研究发现相比传统的TRIzol试剂，商品化TRIzon节约了前期配置试剂的时间，但成本相对较高，平均4.03元/样；自配的TRIzol试剂保留了TRIzol试剂基本成分，但提取成本降低（平均0.2元/样），且自配TRIzol试剂的RNA提取效果稍优于商品化的TRIzol试剂，更适用于大规模的植物叶片的RNA提取试验。

3.2 RNA提取过程中的注意事项

RNA 提取的质量容易受多种因素影响。本研究中为避免样品反复冻融，试验材料研磨后分装保存于超低温冰箱。为防止核酸酶的影响，研磨样品所用研钵、研杵均于0.1%的DEPC水中浸泡过夜、高压灭菌后烘干；使用的离心管、枪头等一次性耗材均为RNA 提取试验专用耗材；RNA 的溶解、稀释及75%乙醇的配制均使用RNase-free 水。为减少RNA 降解，本试验全程在冰上操作，保持低温。为减少人为因素的影响，操作人员全程严格按照RNA 提取的相关要求进行，样品的采集、处理、RNA 提取等步骤，均佩戴无菌手套及口罩，保证了该试验结果的严谨性及适用性。

4 结论

综合提取方法操作的简便程度、成本高低、提取效率以及总RNA 的纯度、浓度等因素，自配TRIzol 试剂法是四种竹叶总RNA 提取的最优方法。此外，商品化TRIzon 法取效果与自配TRIzol 法相比差别不大，但成本较高，可在少量的RNA 提取试验中使用。RNA 试剂盒法及改良CTAB法在本试验中提取的RNA纯度和浓度较差，且RNA试剂盒法成本高，改良CTAB法耗时较长，两种方法都不适用于竹叶的总RNA提取。