Hedgehog信号通路在激素性股骨头坏死作用机制中的研究进展

胡康一 曹林忠 尚征亚 杨小瑞 万超超 张勇杰

【摘 要】 糖皮质激素的不正确使用导致股骨头内骨代谢异常、脂代谢失衡、血微循环障碍是激素性股骨头坏死发生、发展的重要原因之一。Hedgehog通路作为一条高保守信号通路，在组织器官骨骼的形成发育以及疾病过程中有着重要调控作用。近年来，随着精准医学的进一步发展以及对于细胞和分子生物学的广泛深入研究，发现Hedgehog信号通路可以通过促进骨髓间充质干细胞成骨分化，抑制脂肪细胞的生成，加速血管内皮细胞的新生对激素性股骨头坏死进行有效的靶向调控。现以Hedgehog信号通路在激素性股骨头坏死病理机制中发挥的调控作用进行综述，以期为临床治疗激素性股骨头坏死提供精确的靶点。

【关键词】 激素性股骨头坏死；Hedgehog信号通路；骨髓间充质干细胞；成骨成脂分化；血管内皮细胞；研究进展；综述

激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是因糖皮质激素的不正确使用导致骨小梁结构改变，在机械力的作用下，发生微小骨折，导致股骨头塌陷变形，进一步压迫骨内微血管，同时在激素的刺激下会激活血栓形成和脂肪栓塞，导致股骨头内血管损伤，局部骨组织缺血性坏死，进而继发严重的髋关节病变，使得致残率高居不下［1］。尽管激素诱导SANFH的发病机制尚不完全清楚，但有研究表明，激素诱导的骨代谢异常、股骨头血液供应受阻、脂代谢紊乱是SANFH的重要发病机制。

Hedgehog信号通路是一条高保守信号通路，参与多种细胞的增殖与分化，在组织和器官的发育中起着重要作用［2］。研究表明，Hedgehog信号通路可以通过多种途径调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨成脂分化和成骨活性，同时也能促进血管修复与新生，这与SANFH的机制相同，因此，Hedgehog信号在SANFH的防治中起着重要作用。本文从Hedgehog信号通路的概况出发，综述Hedgehog通路在调控细胞成骨成脂分化以及血管生成的作用，为SANFH的临床防治提供一个重要思路。

1 Hedgehog信号通路

Hedgehog基因首次于1980年在果蝇胚胎发育过程中被发现，由于其基因变体出现的连续小齿和毛状刚毛草坪，像幼虫表皮中伸出的刺猬刺而被命名为Hedgehog。这种通路同样也存在于人类中，是一种高度进化保守的通路，几乎在哺乳动物所有组织及器官发育和体内平衡和再生中都起着至关重要的作用。Hedgehog基因家族主要包括3种同源基因：Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）、Desert Hedgehog（DHH）。SHH和IHH信号在许多组织中有着相似但不完全相同的重要功能，在胚胎的发育过程中至关重要。SHH对干细胞成骨成脂分化有调节作用，参与骨形成；IHH负责软骨及软骨内骨的形成；DHH基因仅限于性腺［3］。Hedgehog转录物翻译成Hedgehog蛋白后通过蛋白质裂解、糖基化和脂质修饰后被运输到内质网中，并被自身蛋白分解为C-端Hedgehog和N-端Hedgehog，Hedgehog的N端半部分通过分子内蛋白水解反应与胆固醇共价锚定，同时裂解无活性的C端多肽，随后Hedgehog酰基转移酶将棕榈酰基转移到Hedgehog的N端半胱氨酸上，双脂修饰的N-端Hedgehog分泌并与质膜的膜结合蛋白结合，从细胞中释放出来［4］。

Hedgehog基因传导涉及多个主要成分，除了3种同源基因SHH、IHH、DHH蛋白受体以外，还有位于初级纤毛上的跨膜结构域受体蛋白补丁（PTCH）、跨膜G蛋白偶联受体（SMO）、神经胶质瘤相关癌基因（GLI）转录因子和细胞质中融合抑制因子（SUFU）［5］。经典的Hedgehog信号通路通过SMO激活，SMO是一种生物信号传感器的7次跨膜蛋白，是激活Hedgehog通路的关键蛋白受体，它包含3个功能结构域，N末端富含半胱氨酸结构域、七螺旋跨膜结构域和长胞质尾。从细胞内囊泡到细胞表面进行翻译后修饰，SMO通过蛋白激酶A、酪蛋白激酶1或酪蛋白激酶2和GPCR激酶等蛋白激酶进行磷酸化，随后进行Hedgehog信号传导［6］。PTCH是一种12次跨膜糖蛋白，对Hedgehog通路起着负调节作用。PTCH包含一个甾醇感应结构域［7］，

在没有Hedgehog配体的情况下，PTCH抑制SMO在初级纤毛上的聚集，导致下游级联反应失活。而在有Hedgehog配体的情况下，PTCH会与Hedgehog受体结合，Hedgehog-PTCH在膜重塑GTPase dynamin和HECT结构域泛素E3连接酶Smurf1/2的参与下发生内吞作用；然后Hedgehog和PTCH在溶酶体中都被降解，从而消除PTCH介导的SMO抑制，释放SMO，使SMO在纤毛尖端聚集［8］。Hedgehog信号通路激活后，会诱导Gli家族成员进入细胞核。Gli是一种Krüppel样转录因子，包含具有双重活性的锌指DNA结合结构域，该家族有3种具有基因相似的DNA集合结构域的蛋白Gli1、Gli2、Gli3［9-11］。所有的家族成員都包含C末端激活结构域，但Gli2和Gli3包含N末端转录抑制结构域，因此，Gli2和Gli3是双功能转录因子，它们以全长形式充当转录激活因子，也可以转化为低分子量转录抑制因子，在Hedgehog信号通路中，Gli1、Gli2起着激活作用，Gli3起着抑制作用，Gli转录因子负责调节Hedgehog通路末游靶基因。在没有Hedgehog配体情况下激酶通过磷酸化Gli，将全长Gli蛋白水解成阻遏物形式抑制Hedgehog靶基因的子集，在细胞外Hedgehog配体存在的情况下，Gli1的全长活性形式被转移到细胞核中，减少纤毛cAMP［12-14］。全长Gli保存在一个微管相关蛋白复合物中，该复合物含有驱动蛋白、SUFU和激酶。SUFU也参与Hedgehog信号的调控，它直接作用于Gli，是Hedgehog通路的负调节因子［15］。在没有Hedgehog受体的情况下，SUFU直接与Gli结合并使其稳定，防止全长Gli转移到细胞核内从而导致Hedgehog信号的传导。在Hedgehog配体的激活过程中，SMO在初级纤毛中累积，导致SUFU磷酸化，减弱对Gli的结合能力，Gli核位移能力增强，从而促进Hedgehog信号传导［16］。相比之下，非规范Hedgehog信号通过Patched1发生，不完全依赖于SMO和Gli激活。

2 Hedgehog信号通过多途径影响SANFH

糖皮质激素的大量使用会诱导股骨头中BMSCs的成骨成脂分化能力失衡，成骨减少，成脂增加，导致骨小梁减少，引起局部骨组织塌陷变形，阻碍股骨头周围血液循环，进一步促进SANFH的发生、发展。因此，提高BMSCs的成骨分化能力，改善或恢复骨小梁形态，刺激血液循环是治疗SANFH的关键。Hedgehog信号作为在各种细胞分化和增殖、组织器官的发育过程中都起着重要作用的通路，在调控骨代谢、促进成骨细胞分化、调控细胞因子、促进血管再生方面同样也发挥着关键作用［17］。

2.1 Hedgehog信号通过促进成骨分化影响SANFH Hedgehog作为一条高保守信号传导通路，通过调控间充质干细胞（MSCs）的成骨成脂分化，对骨重建与骨构塑起正向调控作用，可以延缓或抑制SANFH的進程。有研究发现，在对大鼠外MSCs进行成骨诱导的过程中，SHH和Gli1的表达水平上升，且与没有进行诱导的细胞相比，碱性磷酸酶（ALP）活性更高，矿化结节更多［18］；在高浓度葡萄糖条件下，BMSCs向成骨的分化能力降低，在细胞中SHH的表达、基质矿化结节形成、ALP活性，以及骨形态发生蛋白-4（BMP-4）、骨唾液蛋白（BSP）和骨桥蛋白（OPN）的表达水平都大幅度降低，但通过Lenti?SHH激活SHH信号，BMSCs中基质矿化结节的数量、ALP活性以及BMP-4、BSP和OPN的表达水平都得到明显改善［19］；同时，在柚皮苷诱导BMSCs的成骨分化中，也可测得IHH蛋白水平上升，但在IHH抑制剂环巴明的处理下，BMSCs中ALP活性降低，且核心结合因子α1、骨钙素和BSP的mRNA均下降［20］；此外，在敲除IHH基因的小鼠模型中，发现小鼠的成骨细胞较少，几乎没有皮质骨和骨小梁，成骨相关基因水平降低，在体外培养的成骨细胞中缺乏IHH基因会抑制其增殖分化和矿化能力［21］。说明SHH、IHH均可以调控BMSCs的成骨分化且呈正向关。

除了直接调控SHH、IHH信号通路外，Hedgehog通路中的上下游因子也参与成骨分化。研究人员在Gli1+/-成年小鼠模型中分析得出，Gli1单倍体不足导致骨量减少，骨形成减少，骨吸收加速，在Gli1+/-前体的培养中，Hedgehog通路介导的成骨细胞分化严重受损，而通过腺病毒转导的Gli1表达上升挽救了这种损伤［22］；并且通过抑制Hedgehog目标基因Gli1的激活降低MSCs中成骨分化标记物的蛋白表达，抑制成骨分化［23］，但通过结合SMO受体，诱导Gli1发生核转运，亦可以增加间充质细胞的成骨分化来调节骨重塑［24］，证明作用于Hedgehog信号下游的Gli1参与成人成骨细胞的分化。SUFU作为Hedgehog通路的负调节因子，在骨质疏松大鼠模型中呈过表达状态，SHH、SMO、PTCH和成骨标志物BMP-2、Runt相关转录因子（Runx2）的表达随着SUFU的高表达而下降，通过靶向抑制SUFU的过表达，激活Hedgehog信号通路，可以促进大鼠的成骨细胞增殖和分化［25］。

Hedgehog信号通路也可以作用于与骨形成有关的信号及关键分子，间接调控BMSCs成骨分化。在腺病毒转导生长因子BMP-2与IHH联合培养的MSCs中，ALP、OPN、骨钙素的表达均增加，矿化能力增强，表明IHH与BMP-2协同作用诱导MSCs成骨分化［26］；Hedgehog激动剂Hedgehog-Ags可以强烈激活内源性Gli1的表达，并促进MSCs的成骨细胞分化，Hedgehog-Ags激活经典成骨信号Wnt传导并与低剂量BMP-2协同作用以增强成骨细胞潜能，同时挽救了Runx2丢失小鼠模型中的成骨细胞分化缺陷［27］；并且在使用Hedgehog激动剂处理Runx2+/-小鼠后，可以促进骨形成和小鼠颅骨缝线闭合，但使用Hedgehog拮抗剂处理野生小鼠却抑制骨形成和MSCs的增殖。说明Hedgehog信号通路可以激活其他骨形成通路以及成骨相关因子，间接促进成骨细胞分化和骨形成［28］。

以上研究均可以证明，Hedgehog通路不仅是SHH、IHH信号和下游关键分子参与BMSCs的成骨分化及成骨细胞的生成增殖，调控骨形成，还可通过与成骨相关其他信号及关键分子的交互影响，共同调控骨的形成，经此通路增加成骨的分化增殖是治疗SANFH的可行路径。

2.2 Hedgehog信号通过抑制成脂分化影响SANFH BMSCs的成骨与成脂分化存在着负相关关系，高剂量的糖皮质激素会诱导BMSCs的分化从成骨细胞谱系转移到脂肪细胞谱系，导致成骨减少。同时，糖皮质激素会上调脂基因转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的基因表达，这与BMSCs的成脂分化密切相关。研究表明，所有促脂肪细胞生成的信号通路都与PPARγ相关，当敲除PPARγ基因后，均无法诱导脂肪细胞的形成。SMO激活剂SAG可以通过增加Gli1、SMO的含量，下调PPARγ和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的含量，从而抑制3T3-L1脂肪细胞中的脂肪形成［28］；在使用Hedgehog信号抑制剂以后，逆转了AMPK激活剂导致C/EBPα和PPARγ的表达下降，脂肪细胞的分化增强［29］。这表明，通过激活Hedgehog信号传导可以抑制脂肪细胞的分化［30］。在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中，Hedgehog信号通路被抑制，但通过激活Hedgehog通路靶向调控C/EBPα和PPARγ的表达，导致脂肪形成大大受损，脂质堆积减少，脂肪细胞特异性标志物减少，并获得胰岛素抵抗表型，抑制BMSCs的成脂分化［31］；并且在含有SHH的成脂诱导液培养小鼠BMSCs细胞系C3H10T1/2后发现，SHH能有效阻断C3H10T1/2细胞向脂肪细胞分化，而加入Hedgehog信号通路抑制剂后，极大程度上恢复了C3H10T1/2细胞的成脂能力［32］。有研究发现，在SANFH模型中，激素下调Hedgehog信号通路配体SHH和转录因子Gli2的表达水平，促进脂肪形成标记物PPARγ和C/EBPα的表达和抑制骨形成标记物Runx2及胶原蛋白CollagenⅠ的表达，通过补肾活血胶囊的有效成分可以激活Hedgehog信号通路，通过Gli2下调PPARγ和C/EBPα的表达，改善激素引起的股骨头内脂肪过量形成［33］。

综上，通过促进Hedgehog信号通路的激活，抑制C/EBPα和PPARγ的表达，可以降低BMSCs的成脂分化，抑制脂肪细胞的形成，延缓SANFH的发展进程。

2.3 Hedgehog信号通过促进血管修复影响SANFH 糖皮质激素的不规范使用会使内皮细胞凋亡，损伤血管形成，影响股骨头周围血液供应，导致股骨头缺血性坏死，因此，调控血管修复与新生是治疗SANFH的重要思路。Hedgehog信号通路作为调控血管生成的重要通路，通过调节血管内皮细胞相关的因子，促进血管修复和新生治疗缺血性疾病。血管内皮生长因子（VEGF）是有效的血管通透性诱导因子，具有较强的促血管生成作用，血管生产素（Ang）可以促进血管壁生长、繁殖、损伤组织再生，它们都在SANFH中扮演着重要角色。BMSCs可以分化成内皮细胞，但分化效率較低，通过在慢病毒转导的BMSCs中过表达SHH，Ang-1、

胰岛素样生长因子1（IGF1）和VEGF-A等增加［34］，说明SHH通过VEGF可以促进BMSCs向内皮分化，增加了血管生成能力。用SHH的药理学调节剂培养的MSCs中，能检测出激活素A、Ang-1、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶-9，以及尿激酶型纤溶酶原激活剂等血管生成因子的分泌，证明SHH通路可以增强BMSCs的促血管生成能力［35］，也可以通过激活Hedgehog通路，上调Patched、SMO和Gli的表达，引起通路下游因子VEGF、Ang-2的表达，最终促进血管生成［36］。细胞中低氧诱导因子-1α（HIF-1α）是VEGF的上游因子，能通过刺激VEGF的转录，增加血管新生能力。研究发现，通过抑制Hedgehog通路，可以下调HIF-1α、VEGF-A的表达，从而抑制血管生成［37］。在使用HIF-1α抑制剂后，SHH、SMO、Gli-1的含量，VEGF表达以及血管数量均下降［38］，证明Hedgehog通路能够调控VEGF上游因子HIF-1α，从而调控血管生成。在糖皮质激素诱导的股骨头坏死大鼠模型中，SHH、Gli1与Gli2的表达被干扰，Hedgehog通路被抑制，从而引发了大鼠股骨头内血管损伤，而经过补肾活血胶囊治疗，逆转了SHH、Gli1与Gli2的低表达，促进血管再生，有效治疗SANFH［39］。

上述研究均表明，Hedgehog信号通路正向调节血管修复与新生，通过介导血管相关因子的生成修复受损血管，从而有效改善股骨头血供。

2.4 初级纤毛通过调控Hedgehog信号影响SANFH 初级纤毛作为细胞天线，在正常的细胞发育及稳态的过程中起着重要作用，是Hedgehog信号通路必不可少的组成部分，Hedgehog信号相关因子的激活均发生在初级纤毛上。初级纤毛通过调控Hedgehog信号的激活参与MSCs的成骨分化。研究发现，通过增强MSCs中纤毛的生成，可以激活Hedgehog信号通路，同时提高细胞的机械敏感性，促进成骨相关基因的表达［40］，而通过抑制纤毛化则降低了Gli1和成骨细胞分化标志物ALP基因的表达［41］，说明通过纤毛可以调控Hedgehog信号通路促进成骨分化。初级纤毛本身缺乏合成系统，需要通过鞭毛内运输蛋白（IFT）介导的沿微管运行的双向物质运输系统，从细胞内装运所需物质［42］。因此，IFT蛋白家族可以通过调节初级纤毛的结构及功能，进一步调控Hedgehog信号通路。IIFT88是一种含有四肽重复序列的蛋白质，是鞭毛内复合物B的中心部分，对初级纤毛的形成至关重要。通过刺激MC3T3-E1细胞（成骨细胞谱系）中纤毛蛋白、IFT88 mRNA的表达，上调SHH、Gli1和Gli2的水平，促进成骨分化和成骨细胞的成熟［43］。同时，在MC3T3-E1成骨细胞中，使用纤毛蛋白IFT88的小干扰RNA（siRNA）处理，会降低成骨细胞中Gli1和骨钙蛋白、Runx2和ALP的表达［44］。IFT80同样也属于IFT蛋白家族，是定位于成骨细胞及骨细胞表面初级纤毛的一种蛋白质。在小鼠成骨细胞前体中发现，缺失IFT80会破坏SMO纤毛定位从而阻断Hedgehog-Gli信号，导致成骨细胞生成缓慢，骨量显著减少，成骨细胞分化受损，但在应用肌动蛋白失稳剂细胞松弛素D后，可明显恢复IFT80缺陷的成骨细胞分化［45］。

这些研究表明，初级纤毛和IFT蛋白家族可以通过激活Hedgehog通路促进成骨分化，以及成骨细胞的成熟，改善SANFH中成骨减少、骨量丢失的症状，不失为治疗SANFH的一种新途径。

3 小结与展望

尽管SANFH的发病机制尚未完全阐明，但与BMSCs的成骨成脂分化失衡，成骨细胞数量和活性降低，以及股骨头的血液循环障碍密切相关。Hedgehog信号通过调节自身上下游因子以及通路特殊结构初级纤毛来调控BMSCs的成骨分化，抑制脂肪细胞的形成，促进骨的形成与修复，正向调节血管修复与新生。因此，可以把Hedgehog通路作为治疗SANFH的切入点，通过调控该通路的关键因子，达到防治SANFH的目的。深入了解Hedgehog通路与SANFH发病关系，为研发SANFH药物提供理论基础，以期开发出以Hedgehog通路为基础的药物治疗SANFH，实现基础到临床的转化，最终服务于临床。

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收稿日期：2023-05-15；修回日期：2023-06-30