阳和解凝膏联合梅花针对局限性硬皮病小鼠TGF-β1/Smad3信号通路的影响

白雨 李丹 孔洁 韩慧 王红

【摘 要】目的：觀察阳和解凝膏联合梅花针对局限性硬皮病小鼠模型转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad同源物3（Smad3）信号通路的影响。方法：将36只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肝素钠组、阳和解凝膏组、梅花针组、阳和解凝膏联合梅花针组（联合治疗组），每组6只。除空白对照组外，其余各组小鼠均皮下注射博莱霉素建立局限性硬皮病小鼠模型。治疗4周后，处死小鼠取皮肤组织，采用Rodnan评分观察皮肤受累程度，HE染色观察皮肤组织病理学变化，偏振光皮肤镜观察皮肤组织表面血管和毛发的变化情况，免疫组织化学染色检测皮肤组织中TGF-β1、白细胞介素-4（IL-4）、Smad3、Smad7的表达；Masson特殊染色检测皮肤胶原纤维的面积。结果：阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠治疗后皮肤组织表面血管和毛发恢复生长；HE染色观察真皮变薄；Masson特殊染色胶原纤维面积减少；TGF-β1、IL-4、Smad3表达降低，Smad7表达升高，且以联合治疗组效果最佳，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：阳和解凝膏、梅花针可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达干预局限性硬皮病小鼠皮肤组织纤维化。阳和解凝膏联合梅花针治疗局限性硬皮病小鼠可以起到协同增效的作用。

【关键词】 局限性硬皮病；阳和解凝膏；梅花针；TGF-β1/Smad3信号通路；小鼠

The Effect of Yanghe Jiening Gao（阳和解凝膏）Combined with Plum-blossom Needle on TGF-β1/Smad3 Signaling Pathway in Mice with Localized Scleroderma

BAI Yu，LI Dan，KONG Jie，HAN Hui，WANG Hong

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Yanghe Jiening Gao（阳和解凝膏）combined with

plum-blossom needle on TGF-β1/Smad3 signaling pathway in mice with localized scleroderma.Methods：

Thirty-six female BALB/c mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，

a heparin sodium group，a Yanghe Jiening Gao group，a plum-blossom needle group，and a combination of Yanghe Jiening Gao and plum-blossom needle group（the combined treatment group），with 6 mice in each group.Except the blank control group，all other groups of mice were subcutaneously injected with Bleomycin to establish mouse models of localized scleroderma.After 4 weeks of treatment，the mice were euthanized and skin tissue was taken，and the degree of skin involvement was observed using the Rodnan skin thickness score;HE staining was used to observe pathological changes in skin tissue;changes in blood vessels and hair on the surface of skin tissue were observed using polarized light dermatoscopy;immunohistochemical staining was used for detecting the expression of

TGF-β1，IL-4，Smad3，and Smad7 in the skin tissue;Masson special staining was used to detect the area of collagen fibers in the skin.Results：After treatment，the blood vessels and hair on the surface of the skin tissue of mice in the Yanghe Jiening Gao group，the plum-blossom needle group，and the combined treatment group resumed growth;HE staining observed thinning of the dermis;Masson's special staining reduced the area of collagen fibers;the expression of TGF-β1，IL-4 and Smad3 decreased，while the expression of Smad7 increased，and the combined treatment group had the most significant therapeutic effect，with statistical significance（P < 0.05）.Conclusion：Yanghe Jiening Gao and plum-blossom needle can inhibit the expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway to intervene the skin tissue fibrosis in mice with localized scleroderma.The combination of them have a synergistic effect on the treatment of localized scleroderma in mice.

【Keywords】 localized scleroderma;Yanghe Jiening Gao（阳和解凝膏）;plum-blossom needle;TGF-β1/Smad3 signaling pathway;mice

硬皮病是一种以皮肤黏膜纤维化和硬化为特征的自身免疫性结缔组织疾病［1］。西医治疗硬皮病多采用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，但效果欠佳。硬皮病属中医学“皮痹”范畴，病机多为风寒湿邪导致经络气血痹阻。阳和解凝膏有温通经络、化痰祛瘀等功效，与硬皮病病机相符。梅花针可以调节经络气血、增加外用药的经皮渗透效率。阳和解凝膏及梅花针操作简单、治疗安全，经临床验证无不良反应。但中药外用及梅花针治疗硬皮病多局限于临床病例报道［2］，缺乏实验研究验证。因此，本研究通过动物实验，观察阳和解凝膏及梅花针治疗局限性硬皮病小鼠的疗效，探讨上述治疗方法对转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad同源物3（Smad3）信号通路的影响，为今后的临床治疗提供更可靠的依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雌性BALB/c小鼠36只，体质量18～22 g，购自斯贝福生物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。

1.2 实验药物 阳和解凝膏药物组成：牛蒡子1500 g，桂枝、大黄、当归、肉桂、草乌、川乌、地龙、僵蚕、赤芍、白芷、白蔹、白及各60 g，川芎120 g，续断、防风、荆芥、五灵脂、木香、香橼、陈皮各30 g，乳香、没药各60 g，苏合120 g，

麝香30 g。均由包头医学院第二附属医院中药房提供。配制方法：除后4味外，其他中药共入麻油中熬枯滤渣，后入黄丹（每500 g油中加黄丹210 g）熬炼成膏，使用前再加热混合后4味中药

细末。

1.3 实验试剂 盐酸博来霉素（日本化药株式会社，批号600700）；梅花针（北京中研太和医疗器械有限公司，批号20192200580）；肝素钠乳膏（博士伦福瑞达制药有限公司，批号20042302）；Masson三色染色试剂盒（索莱宝科技有限公司，批号G1340）；TGF-β1、IL-4、Smad3、Smad7试剂盒（博奥森生物技术有限公司，批号bs0086R、bs2463R、bs3484R、bs0566R）。

1.4 实验仪器 石蜡切片机（德国徕卡，型号rm2235）；光学显微镜（Olympus，型号CX31）；偏振光皮肤镜（Dino-Lite，型号AM4113ZT4）。

2 方 法

2.1 分组、动物模型制备与样本采集 将36只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肝素钠组、阳和解凝膏组、梅花针组、阳和解凝膏联合梅花针组（联合治疗组），每组6只。将所有小鼠背部剔去约1.5 cm×1.5 cm的毛发，除空白对照组外，其余小鼠均背部皮下注射博莱霉素磷酸盐缓冲液

0.1 mL（浓度为200 μg·mL-1），每日1次；空白对照组小鼠背部皮下注射磷酸盐缓冲液，注射方法和剂量同前。造模4周后，阳和解凝膏组小鼠给予阳和解凝膏外敷治疗，药膏在酒精灯上加温软化后贴于小鼠背部皮肤，每贴药膏贴敷2 d；梅花针组小鼠给予梅花针扣刺治疗，小鼠背部皮肤碘伏消毒后，拇指、食指捏住梅花针针柄末端，上下颤动针头，利用腕部力量轻扣，扣刺速度快、幅度小，以局部皮肤有出血点为度，治疗结束后再次消毒，每日1次；联合治疗组小鼠分别给予阳和解凝膏外敷及梅花针扣刺治疗，药膏贴敷2 d后予1次梅花针扣刺治疗；肝素钠组小鼠给予肝素钠乳膏外用治疗，每日1次。治疗期间各组小鼠均自由饮水、饮食，治疗4周后将各组小鼠通过脊椎脱臼法处死，取背部注射区皮肤组织，放入质量分数为4%的甲醛溶液固定。

2.2 整体状态评估及Rodnan评分 治疗期间观察各组小鼠的身体状态、活动量等情况；每周根据皮肤受累的严重程度进行改良Rodnan评分［3］（0分，正常皮肤；1分，轻度硬厚；2分，明显硬厚，不能推动；3分，严重硬厚，不能捏起）。

2.3 HE染色 HE染色后，于光学显微镜下观察皮肤组织病理变化并收集图像。

2.4 Masson特殊染色 Masson特殊染色后，胶原纤维、细胞核呈蓝色，细胞浆、红细胞、肌肉纤维呈红色，用ImageJ图像分析软件采集胶原容积分数（即蓝色面积占总面积的百分比）。

2.5 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色后，于显微镜下观察，棕黄色为阳性，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件采集光密度（IOD）及面积（Area），再计算出平均光密度（即光密度·面积-1）进行分析。

2.6 皮肤镜 各组小鼠治疗4周后应用偏振光皮肤镜检测小鼠背部皮肤组织表面血管和毛发的变化情况。

2.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，组间比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各組小鼠一般状态及Rodnan评分比较 空白对照组小鼠的身体状态良好，皮肤弹性较好。模型对照组小鼠出现活动减少，摄食水分和食物减少，毛发明显脱落，毛发脱落部位皮肤硬化明显，不能捏起。阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠状态好，接近于空白对照组小鼠，皮肤弹性可，牵拉易提起。Rodnan评分结果见表1。

3.2 各组小鼠皮肤镜下表现 空白对照组小鼠毛发均匀分布；模型对照组小鼠见白色无结构区，线状血管，毛囊受损、萎缩；肝素钠组小鼠见少量毛发及线状、点状出血；阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠毛发恢复生长；梅花针组小鼠背部皮肤结痂愈合。见图1。

3.3 各组小鼠皮肤组织病理学改变 空白对照组小鼠皮肤组织结构完整，表皮层及真皮层无明显增厚，胶原纤维无明显增生；模型对照组小鼠皮肤真皮层略增厚，胶原纤维增生，部分胶原均质化，毛囊、汗腺明显减少；肝素钠组小鼠皮肤组织病理变化情况与模型对照组无明显差别；阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠皮肤组织病理改变趋向于空白对照组。见图2。

3.4 各组小鼠背部皮肤Masson特殊染色组织 模型对照组蓝色（胶原纤维）面积最大，空白对照组蓝色面积最小，阳和解凝膏组及梅花针组蓝色面积明显变小。与空白对照组比较，其余5组胶原纤维面积均明显增加（P < 0.05）；与模型对照组比较，阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组胶原纤维面积均明显减少（P < 0.05）。见图3、表2。

3.5 各组小鼠背部皮肤组织TGF-β1、IL-4、Smad3、Smad7表达比较 TGF-β1、IL-4、Smad3阳性表达主要在真皮层的炎症细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的细胞膜上，Smad7主要在成纤维细胞的细胞浆。与空白对照组比较，模型对照组及肝素钠组TGF-β1、IL-4、Smad3的阳性表达显著升高

（P < 0.05），Smad7阳性表达明显减弱（P < 0.05）；与模型对照组比较，阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组TGF-β1、IL-4、Smad3阳性表达明显下降，Smad7阳性表达明显升高（P < 0.05）。見表3。

4 讨 论

硬皮病的发病机制尚不明确，与自身免疫异常、炎症因子、致病通路等都有关系。研究发现，TGF-β1/Smad信号通路是TGF-β发挥生物学效应的主要通路［4］。TGF-β1可以促进成纤维细胞自分泌TGF-β［5］，TGF-β与下游的Smad3结合后再与Smad4形成复合物并易位到细胞核，参与靶基因的转录激活［6］。Smad3为受体活化型，不仅可以增加胶原的合成，而且还可以减少金属蛋白酶的降解和增加金属蛋白酶的抑制剂促进纤维化的发

生［7］；Smad7为抑制型Smad，在该通路起负向调节作用［8］。IL-4不仅可以调节TGF-β细胞水平［9］，还可以刺激细胞内的胶原形成。研究发现，硬皮病患者的血浆、外周血单核细胞及肺脏标本均检测到IL-4水平升高［10-11］。通过对本次实验小鼠HE染色、Masson特殊染色及皮肤镜观察，除空白对照组外，各组小鼠背部皮肤均有真皮厚度增加、胶原纤维增粗、毛囊及脂肪组织萎缩，证明局限性硬皮病小鼠造模成功。

硬皮病属中医学“皮痹”范畴，其病因与风寒瘀三邪有密切关系［12］。气血失和造成血液运行不畅使局部肌肤失养是硬皮病的主要病机。阳和解凝膏出自清代王维德的《外科全生集》，有温经和阳、化痰通络等功效［13］。阳和解凝膏其核心为“阳和”二字，阳为温热的、上升的阳气；和为调和、协调之意。利用温阳药物使阳气的温煦作用中和阴寒之毒，对因治疗；使用调理气血、疏通经络的药物使人体阴阳诸气调和理顺，对症治疗。方剂中牛蒡子宣肺透疹，消肿止痛；桂枝温经通脉；荆芥、防风解表散风；白芷散风除湿，通窍止痛；大黄逐瘀

通经；川芎活血行气，祛风止痛；白蔹清热解毒，消痈散疖；乳香、没药活血，散瘀止痛；白及入肺经，专攻收敛；草乌祛风除湿，温经止痛；肉桂、麝香活血通经；续断补肝肾，强筋骨，用于风湿痹痛；当归补血活血，调经止痛，温阳与辛散之品相配伍，使风寒瘀之毒随津液排出体外，达到温阳化湿、活血化瘀、消肿散结之功效［14-15］。梅花针以中医经络的“十二皮部”理论为依据。术者右手握住针柄，在皮肤（应刺部位）上运用一定的手法，只叩击皮肤，不伤肌肉，以达到疏通经络、活血祛瘀、防治疾病的功效［16］。此外，梅花针还有调节局部血液循环，改善微血管的功能［17］。梅花针对皮肤产生刺激，针感能够伴随刺激位置的不同驱动相应区域经脉之气循行，促使针感传至希望抵达的脏腑、筋肉以及关节等特定部位，进而起到定向性调节经络气血以及内脏功能等治疗效果［18］。本次实验运用阳和解凝膏和梅花针治疗局限性硬皮病小鼠，阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠的毛发恢复生长，活动量及食欲增加，皮肤弹性恢复；皮肤镜下线状血管及白色无结构区较模型对照组明显减少；Masson特殊染色下胶原纤维面积减少趋向于空白对照组小鼠，皮肤硬化程度逐渐减轻，疗效确切，说明阳和解凝膏及梅花针治疗局限性硬皮病小鼠效果显著。阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠皮肤组织中的TGF-β1、Smad3、IL-4表达降低，Smad7表达升高，证实了阳和解凝膏及梅花针治疗局限性硬皮病小鼠通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达改善皮肤组织纤维化。经过治疗后，阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠皮肤组织的IL-4含量较模型对照组小鼠降明显降低，说明阳和解凝膏及梅花针可以通过减轻炎症因子的表达改善局限性硬皮病小鼠皮肤组织纤维化。本次实验为局限性硬皮病的治疗，局部外用阳和解凝膏及梅花针叩刺避免了口服中药带来的首过消除效应，局部应用使药效发挥最大。梅花针扣刺还可以促进阳和解凝膏的透皮渗透吸收，使两者联合治疗起到协同增效的作用。

综上所述，阳和解凝膏和梅花针可以通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路的表达改善皮肤组织纤维化，且阳和解凝膏联合梅花针的治疗效果优于单一治疗方式。

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收稿日期：2023-07-15；修回日期：2023-08-22