蔓越莓预防儿童神经源性膀胱发生尿路感染的药学研究

李桂凤,薛进,朱增燕（苏州大学附属儿童医院,江苏 苏州 215001）

神经源性膀胱（neurogenic bladder，NB）是神经源性膀胱尿道功能障碍的简称，由神经本身的病变或外伤、手术等对神经损害所引起，表现为膀胱逼尿肌或（和）尿道括约肌的功能障碍导致储尿和排尿异常，最后引起双肾功能的损害[1]。尿路感染（UTIs）是神经源性膀胱患儿常见的并发症之一，有文献报道NB患者UTIs的发生率约每年2.5次，且超过1/3的患者需要住院治疗，同时超过1/5的患者需要反复住院治疗[2]，若反复发生尿路感染，会导致肾瘢痕形成，甚至发展为慢性肾功能不全和肾性高血压[3]。随着全球抗生素耐药性和UTIs复发率的增加，人们开始探索新的防治策略，作为一种天然的替代品，新鲜蔓越莓或干果的摄入量，以及来自它们的产品（果汁、提取物等）已被广泛推荐，国内外指南中均提到其可作为植物药用于预防尿路感染，但是目前关于蔓越莓的临床疗效存在一定的争议，可能归因于不同的蔓越莓产品中有效成分含量不同、没有统一的使用剂量标准、缺乏系统的受试者选择和临床试验方案等。本文旨在筛选出适合儿童服用的蔓越莓产品和剂型，为NB儿童确定合适的剂量和频次提供依据。

1 仪器与试剂

SPARK 204型全波长酶标仪（美国帝肯公司）；TGL-20M型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；QUINTIX125D-1CN型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；乙醇、盐酸（36.5%）、丙酮、乙酸（均为分析纯，国药集团有限公司）；原花青素标准品（批号：1 2 2 6 P 0 2 1，北京索莱宝科技有限公司）；4-（二甲氨基）肉桂醛（批号：BCCJ1129，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司）。

2 方法与结果

2.1 观察蔓越莓粉预防尿路感染的效果 回顾性分析40名服用蔓越莓产品的儿童，同时满足以下四项条件：①既往有先天性神经管发育不良或神经损伤病史，影像学或尿动力学检查符合神经源性膀胱诊断[1]；②年龄在4-18岁；③有反复发作性尿路感染[7]：6个月内发作≥2次，或1年内发作≥3次；④既往长期服用抗菌药物预防尿路感染。

该40名儿童中男孩、女孩各20名，年龄在4-18岁，都曾长期服用呋喃妥因、头孢克洛、复方磺胺甲恶口唑、头孢克肟等抗菌药物预防尿路感染，后停用抗菌药物，口服蔓越莓产品。服用的蔓越莓产品和剂量没有统一标准，服用时间在1-6个月不等，其中2名儿童口服蔓越莓产品1个月、4名儿童口服3个月、4名儿童口服6个月后出现尿液浑浊，尿白细胞计数偏高、尿白细胞酯酶阳性；4名儿童口服蔓越莓产品2个月、4名儿童口服蔓越莓产品3个月、22名儿童口服6个月未出现尿路感染症状，尿常规检查结果正常。见表1。结果表明，口服蔓越莓粉2个月内预防尿路感染的有效率为75%，3个月内预防尿路感染的有效率为65%，6个月内预防尿路感染的有效率为55%。

表1 口服蔓越莓产品预防尿路感染的效果

2.2 筛选合适的蔓越莓产品 本试验搜集了市面可售的5种蔓越莓产品，剂型有口服液、散剂、胶囊和片剂，具体结果见表2。说明书中明确提及儿童可用的有1号蔓越莓口服液和3号蔓越莓粉，其中蔓越莓提取物含量较高的为3号蔓越莓粉，因此选择3号蔓越莓粉作为本试验的受试产品。

表2 不同蔓越莓产品的比较

2.3 建立蔓越莓产品中原花青素的含量测定方法

2.3.1 配制标准品溶液 精密称取原花青素（PAC）标准品5mg，用无水乙醇溶解定容至50mL容量瓶中，配制成100mg/L的PAC标准品，分别稀释至50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L。

2.3.2 配制4-（二甲氨基）肉桂醛（DMAC）溶液 玻璃瓶中加入12.5mL去离子水和75mL无水乙醇，再加入12.5mL盐酸（37%）配制成酸化乙醇溶液。精密称取DMAC50mg用酸化乙醇溶液定容至50mL容量瓶，配制成0.1%DMAC溶液。

2.3.3 建立标准曲线 采用DMAC法测定蔓越莓产品中原花青素的含量[4]。精密吸取70μL的空白溶液（80%乙醇）和不同浓度PAC标准品溶液加入到96孔板中，分别在每个孔中加入210μL 0.1%DMAC试剂，充分混匀后将平板放入平板阅读器中，用酶标仪在640nm进行吸光度读数，每5min读取一次数值，重复3次，每个时间点的吸光度读数减去对应的空白吸光度读数，取平均值。以吸光值为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），绘制的标准曲线方程为：y=0.0072x-0.0022，R2=0.9997。结果表明，PAC在浓度6.25mg/L-100mg/L范围内线性关系良好。

2.4 测定蔓越莓粉中原花青素含量 配制PAC萃取液：将75mL丙酮转移到一个装有24.5mL去离子水的玻璃瓶中，并加入0.5mL乙酸。称取蔓越莓粉0.5g放入50mL锥形管中，再加入PAC萃取液20mL，室温超声30min，然后在20℃以2000g离心10min，收集上清液，按2.3.3方法进行DMAC法测定，计算每袋蔓越莓粉中的PAC含量为（82.47±2.91）mg。

2.5 测定蔓越莓粉服用后尿液中原花青素含量 招募10名4-14岁健康儿童为志愿者，男女各5名，在服用蔓越莓粉1包后2h、4h、8h、12h、24h收集中段尿液作为服用后不同时间的样品，样品在4℃条件下保存。按2.3.3方法分别测定不同时间点尿液中PAC浓度。服用蔓越莓粉后，人尿液中PAC含量逐渐升高，服用后8h尿液中PAC含量最高，平均值为（54.76±1.11）mg/L，服用后24h尿液中PAC含量均值为（29.95±0.98）mg/L，结果见图1，因服用后24h尿液中PAC含量仍较高，建议蔓越莓粉可口服每日一次，每次1包。

图1 不同时间点尿液中原花青素浓度（n=10）

3 讨论

目前，抗菌药物仍然是UTIs治疗和预防的金标准，国内外指南推荐的可预防儿童UTIs抗菌药物有甲氧苄啶、呋喃妥因、复方新诺明、阿莫西林克拉维酸钾或头孢克洛类药物口服。但是长期使用抗生素会导致神经源性膀胱患儿胃肠道和泌尿道菌群失调，耐药菌或条件致病菌所致尿路感染的比例上升。尿路感染常见的病原菌有大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等，尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是75%-95%的非复杂膀胱炎和肾盂肾炎最常见的致病菌，UPEC利用它们菌毛附着在尿路上皮细胞受体上，导致细菌增殖，其中三种UPEC菌毛类型与大多数感染有关，包括1型菌毛、P型菌毛和F9型菌毛[5]。一项随机、双盲、安慰剂对照试验[6]表明，与安慰剂相比，食用蔓越莓后的人尿液具有很强的抑制P型和1型UPEC黏附尿道上皮细胞的能力。有研究[7]显示，通过收集摄入蔓越莓提取物后的人尿液，发现白色念珠菌菌株的黏附和生物膜形成显著减少。

临床药师在参与临床工作中发现有一些患儿服用蔓越莓产品预防尿路感染且认同疗效，因此，作者回顾性分析40名反复发生尿路感染的NB儿童口服蔓越莓产品预防尿路感染的效果，以患儿是否有尿浑、尿痛等尿感症状，尿常规检查中以尿白细胞计数、尿白细胞酯酶、尿亚硝酸盐等指标为依据判断是否发生尿路感染。尿白细胞计数、细胞酯酶（U-LE）、尿亚硝酸盐（U-NIT）指标对尿路感染的诊断具有重要的价值，U-LE试验的敏感性约为94%，特异性约为74%[8]。结果表明，蔓越莓产品预防儿童尿路感染具有一定的疗效，可考虑作为抗菌药物的天然替代品，但是市场上蔓越莓产品品种较多，成分不一，使用剂量和频次没有统一标准。因此，临床药师查阅国内外文献中研究蔓越莓预防尿路感染的作用机制和临床研究得知，有效成分主要是蔓越莓中的PAC。本试验建立了蔓越莓产品中PAC的含量测定方法，并用该方法测定10名健康儿童服用适合儿童口服的蔓越莓粉后在不同时间点尿液中PAC的浓度，建议需要长期预防尿路感染的患儿口服蔓越莓粉可以每日一次，每次一包。后期将继续在行泌尿疾病手术后需要长期插导尿管或内置引流管的患儿中观察蔓越莓粉的临床疗效。