分子印迹电化学传感器对食用油中塑化剂邻苯二甲酸二异壬酯的快速检测

黄世慧，潘相玉，张榴萍，周丽绘，王斯峥，罗世龙，张颖霞，胡军

（1 华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237；2 中储粮镇江粮油质量检测中心有限公司，江苏 镇江 212000）

塑化剂是塑料制品加工中常添加的高分子助剂，邻苯二甲酸酯类塑化剂（phthalate acid esters，PAEs）因油溶性强、水溶性低、黏度高等特点成为最常用塑化剂之一，从2007年的270万吨增加到2020年的750万吨[1-2]。PAEs在食品包装塑料制品，尤其是食用油包装中的使用，存在较大的泄漏风险。部分PAEs有致癌风险，世界各国已将PAEs列为严格控制的污染物，制定了一系列的标准法规。我国《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》（GB 9685—2016）规范了对PAEs的管控执行标准。因此，食品中低剂量塑化剂的检测与监控，是提高食品安全的必要举措。

目前对PAEs 的检测通常采用气质联用仪（GC-MS）[3]、高效液相色谱仪（HPLC）[4]、液相色谱联用仪（HPLC-MS）[5-6]等大型仪器进行。虽然上述检测方法线性关系良好、检出限低，但样品的前处理复杂、检测过程耗时长，最后检测结果滞后于生产质量控制需求。因此，大量的研究聚焦于样品前处理的改进。Wu 等[7]制备了磁性邻羟基偶氮苯（M-HAzo）多孔有机聚合物，将其作为新型吸附剂应用于塑料瓶装果汁（PAEs）的预浓缩，并用高效液相色谱-紫外（HPLC-UV）对其进行检测。Montevecchi 等[8]利用优化超声-涡旋辅助分散液液微萃取法（USVADLLME）提取PAEs，并使用GC-MS对PAEs进行含量测定。上述方法还是依赖于大型仪器的检测，难以实现生产现场、市场管理监测部门的快速检测。

分子印迹技术（molecular imprinting technology，MIT）是发展较为成熟的一种化学分析技术[9-11]。分子印迹聚合物[12-13]是将目标分子为模板剂，通过与功能单体的弱分子作用形成空间互补结构，进一步聚合可得到包含目标分子的高交联聚合物；再对目标物进行洗脱，得到具有与目标分子空间构型匹配和多重作用位点的腔穴，使分子印迹聚合物具有识别性能。分子印迹聚合物在传感器[14-15]识别元件中的应用得到了研究者的重视。

因此，本文结合电化学检测的高效便捷性和分子印迹聚合物的高响应性，以PAEs 类塑化剂典型分子邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）为目标分子，在量化计算筛选分子印迹聚合物（MIP）单体基础上，合成了甲基丙烯酸类分子印迹聚合物（DINP-MIP），并制成电化学传感器，对实际食用油中DINP 目标分子及类似塑化剂分子进行检测，为实现食品中低剂量塑化剂快速检测提供了方法和技术。

1 材料和方法

1.1 主要材料

邻苯二甲酸二异壬酯（DINP），分析纯，上海耐澄生物科技有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN），分析纯，强生化工（上海）有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDGMA），分析纯，北京华威锐科化工有限公司；邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）、邻苯二甲酸二(2-乙基己基酯)（DEHP）、甲醇（MT）、乙酸（AC）、乙腈（ACN）、无水乙醇（EA）、铁氰化钾K3[Fe(CN)6]、壳聚糖（CS）等，分析纯，上海泰坦科技股份有限公司；α-甲基丙烯酸（α-MAA），分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；氯化钾（KCl），分析纯，上海众和化学科技有限公司。

1.2 主要仪器

NEXUS-470傅里叶变换红外光谱分析仪，赛默飞世尔科技有限公司；UV-2500紫外可见分光光度计，中国SHIMADZU公司；Tristar-3020比表面积孔径分析仪，美国麦克仪器公司；STA-499热重分析仪，德国NETZSCH公司；JEM-6360扫描电子显微镜和JEM-2100 透射电子显微镜，日本JEOL 公司；PXS7-216精密酸度仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；CHI760电化学工作站，上海辰华有限公司。

1.3 试验过程

1.3.1 以DINP塑化剂为目标的MIP的单体筛选

采用量化计算分析DINP 与不同功能单体之间结合能的大小，利用Material Studio（2019）中的Forcite 模块优化了DINP 与功能单体的几何结构，为了考虑π-π相互作用，采用了GRIME的D2方法（DFT-D），根据式(1)计算得到结合能（BE）。

式中，Ecomplex为目标分子DINP和单体之间的总势能，kJ/mol；Esegment为单体的势能，kJ/mol；EDINP为目标分子DINP的势能，kJ/mol。

1.3.2 分子印迹聚合物（MIP）的合成

采用一锅法自由基聚合制备得到以DINP 为目标分子的分子印迹聚合物DINP-MIP，具体过程如下：向100mL的三颈烧瓶依次加入目标分子DINP、功能单体α-MAA 和致孔溶剂乙腈溶液（10mL），常温下超声1h，聚合3h。预聚合结束后再向三颈烧瓶中加入交联剂EGDMA及40mg的引发剂AIBN，超声混合30min，再通入氮气（N2）以除去系统中的O2，随后进行70℃恒温热聚合，持续搅拌24h。合成过程中通过调变DINP、单体α-MAA以及交联剂EGDMA 之间的比例，获得性能最优的聚合物。反应结束后会得到白色块状产物，采用甲醇和水洗涤3 次，随后60℃真空干燥24h，最终碾碎形成颗粒均匀的粉末。

将上述固体粉末置于锥形瓶中，加入100mL甲醇-乙酸溶液（甲醇∶乙酸=9∶1，体积比）作为DINP 洗脱液，放置在超声波仪器中振荡清洗，多次反复。每次收集上层洗脱液定容后，通过气相色谱-质谱联用仪测试，直至谱图中无目标分子DINP，即聚合物颗粒中目标分子全部洗净。之后用甲醇和水洗涤聚合物，除去多余的酸，最后干燥待用。得到的聚合物标记为DINP-MIP。

对比样品非印迹聚合物（NIP）的制备与上述过程相同，只是在聚合过程中不加入目标分子DINP。

1.3.3 电化学传感器的制备

分子印迹电传感器的制备是将分子印迹聚合物（DINP-MIP）涂覆至丝网电极（SPE）表面形成分子印迹膜。具体为：称取5mg 的DINP-MIP 粉末加入1mL 质量分数0.5%的壳聚糖中，制备浓度为5mg/mL 的混合浆液，超声分散2h直至溶液混合均匀。用微量进样针吸取10μL 上述浆液，滴加到丝网印刷电极表面，室温下自然风干，得到分子印迹聚合物修饰电极（DINP-MIP/SPE）。通过上述方法得到DINP-MIP/SPE。作为对照，NIP/SPE 制备方法与上述一致，只是聚合物更换成非印迹聚合物NIP。

1.4 材料表征

利用傅里叶变换红外光谱分析仪（NEXUS-470）分析材料表面官能团，材料的比表面积和孔径通过美国麦克仪器公司的Tristar-3020 分析仪在77K的N2氛围下测试所得，并采用Brunauer-Emmett-Teller（BET）方程和Barrett-Joyner-Halenda（BJH）算法来计算。利用场发射扫描电子显微镜（JEM-2100）和透射电子显微镜（JEM-6360）对材料形貌进行分析。最后使用热重分析仪（TG-STA-499）在N2氛围下以10℃/min 的加热速率升温，测试材料的热稳定性。

1.5 DINP的等温吸附实验

配制初始浓度分别为3μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、14μmol/L、15μmol/L、20μmol/L和50μmol/L的DINP/ACN标准溶液，分别取8mL 上述标准溶液转移至10mL 的螺旋口玻璃瓶中，然后称取10mg 的DINP-MIP 固体粉末加入其中。溶液在200r/min 的转速下吸附1h。结束后静置，取上清液用0.45μm 的滤膜过滤，得到澄清的滤液。利用紫外-可见光光谱仪进行测试，并根据式(2)计算DINP-MIP对目标分子DINP的吸附量。

式中，qe为聚合物的饱和吸附量，mg/g；C0和Ce分别为DINP溶液的初始浓度和吸附1h后的剩余浓度，μmol/L；V为DINP 标准溶液的体积，mL；M为DINP的标准分子质量，g/moL；m为所加入的吸附材料的质量，mg。

用Langmuir 模型对吸附数据进行拟合分析，Langmuir模型如式(3)所示。

式中，b为Langmuir 的吸附速率系数，L/mg；Ce为吸附平衡时体系中残留DINP的浓度，μmol/L；qe和qm分别为平衡吸附量和单层饱和吸附量，mg/g。

1.6 电化学传感器DINP-MIP/SPE的电化学测试

采用分子印迹电传感器工作电极、对电极（Pt）和参比电极（Ag/AgCl）的三电极系统，利用电化学工作站（CHI760）对传感器进行电化学表征。采用循环伏安法（CV）以及电化学阻抗法（EIS）来探究传感器的电化学响应性，其中电化学工作站CV 检测的电压范围为-0.4～+0.8V，扫描速率为50mV/s，所用氧化还原探针为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]。EIS 检测设置的频率范围为0.1～1×106Hz，静止时间为20s。

在对电化学传感器DINP-MIP/SPE的识别响应测试中，本工作以DINP为目标分子，选择与其结构相似的邻苯二甲酸酯类塑化剂同系物：邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）和邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）作为干扰分子，考察修饰电极对目标分子DINP 的识别能力。评价DINP-MIP/SPE 对不同分子的响应性（IF）定义为MIP传感器相关的ΔIα-MIP与NIP传感器ΔINIP的比值[16]，其计算方法如式(4)，其中ΔI（ΔI=I0-I）为当前电极在相应溶液中吸附前I0与吸附后I响应值之差。

式中，ΔIα-MIP为分子印迹修饰电极MIP/SPE 在目标溶液吸附前后的氧化峰电流差值，μA；ΔINIP为非印迹修饰电极NIP/SPE在目标溶液中吸附前后的氧化峰电流差值，μA；IF 为印迹因子；α-MIP为BBP、DINP、DEHP三种不同结构类似物。

配制pH=7.00、浓度为0～1.00μmol/L的DINP/CAN系列标准溶液，将制备好的分子印迹电化学传感器电极放置于系列浓度的溶液中吸附，保持吸附时间一致，记录氧化峰电流的信号值。并以修饰电极吸附前后所对应的电流变化值ΔIi与对应的目标溶液DINP的浓度Ci（μmol/L）作相关性曲线，计算得到标准曲线的斜率绝对值K。根据信噪比（SNR=3）[17]，采用式(5)、式(6)计算出最低检出限LOD。

式中，K为标准曲线的斜率绝对值；SD 为DINP-MP/SPE 电极对无DINP 的空白溶液平行测量8次后峰电流数值的标准偏差；Xi为第i次测试空白溶液对应的氧化峰电流值；Xˉ为其平均值；N为平行测试的次数。

1.7 食用油品分析

从当地超市购买食用油作为实际样品，添加目标分子DINP 后，先对油品进行简单预处理，然后再采用上述相同方法进行电化学检测。具体操作如下：向1g 待测食用油中分别添加DINP 形成0.1μmo/L、0.3μmo/L、0.5μmo/L 不同浓度，加入10mL 乙腈和正己烷混合溶液（体积比20∶1）萃取剂[18]，超声20min使其充分混合，4000r/min离心收集上清液10mL。将制备好的电传感器插入上述清液中吸附，吸附10min后将电传感器电极自然晾干，再放入到配制好的电解质储备液中，连接三电极体系测试，并记录CV 曲线峰电流响应值变化，完成实际样品的空白加标回收实验。

2 结果与讨论

2.1 DINP-MIP的分子设计

分子印迹聚合物设计过程中，模型分子与功能单体之间作用力的大小决定了聚合物识别性能的强弱。为此，以邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）塑化剂作为目标模型分子，其分子量高达418.62，因具有异壬酯长尾链，分子尺寸较大（1.70nm×0.81nm×0.53nm)。考虑到目标分子DINP含羰基和酯基等特征官能团，选取了5种功能单体，如图1所示，包括α-甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺、丙烯酸、2-乙烯吡啶等含氧、含氮特征官能团的单体，采用量化计算分析阐述目标分子与各个功能单体之间的结合能。

图1 DINP分子分别与5种不功能单体的结合能氢—白色；碳—灰色；氧—红色；氮—蓝色

密度泛函理论（DFT）计算得到的各种聚合物功能单体与DINP分子的结合能（BE）结果表明，功能单体与DINP分子上的羰基/苯环之间通过氢键、静电作用、π-π作用等非共价键作用，结合能绝对值大小排序为：α-甲基丙烯酸（-44.71kJ/mol）＞丙烯酸（-41.02kJ/mol）＞甲基丙烯酸甲酯（-37.07kJ/mol）＞2-乙烯吡啶（-31.24kJ/mol）＞丙烯酰胺（-31.17kJ/mol）。分子印迹聚合物主要通过非共价键弱相互作用形成模型分子腔体，如果作用力太弱，则不能得到包含足够量目标分子的聚合物；反之，作用力太强，将使目标分子难以洗脱、减少识别空腔。因此，针对DINP塑化剂，优选的功能单体为α-甲基丙烯酸。

2.2 DINP-MIP的结构特征

基于分子设计与筛选，以α-甲基丙烯酸为主要单体，按照1.3.2 节所述合成了分子印迹聚合物（MIP）。采用洗脱液萃洗DINP，以形成MIP的识别空腔。萃洗流出液的气相-质谱联机图谱如图2(a)所示，经60min、120min、140min 洗脱后，洗脱液中DINP 的特征峰显著降低，延长洗脱时间至240min，DINP 完全洗脱，成功得到DINP-MIP 印迹聚合物。如图2(b)所示，其傅里叶变换红外（FTIR）光谱和非印迹聚合物（NIP）相似：其中3000～3500cm-1处的伸缩振动峰是由于甲基丙烯酸中—OH 间存在氢键缔合，在1720cm-1、1590cm-1附近出现亚甲基及酯构型的振动峰，说明了功能单体α-MAA的存在[19]。从1728cm-1的特征峰可以看到甲基丙烯酸作为单体中C—O的存在，在1153cm-1和1261cm-1处有α-MAA 单体中—C—O 的振动峰，证实了DINP-MIP和NIP的甲基丙烯酸母体结构[20]。

图2 DINP-MIP合成过程及性质表征图

白色粉末状的DINP-MIP聚合物微观形貌如图3所示，对比溶剂洗脱前后聚合物SEM图可以看出，聚合物中有许多无定形的颗粒组成，这些连续的无规则的颗粒堆积成蓬松的聚合物，溶剂洗脱前后形貌没有改变。TEM图表明洗脱后的DINP-MIP聚合物中存在许多无定形的孔结构，其中介孔、大孔由无规则的聚合物链缠绕堆积形成，促进目标分子DINP在分子印迹聚合物中的扩散，提高吸附速率。

图3 DINP-MIP的电镜图

进一步的孔道结构由77K下N2的吸-脱附等温曲线分析确定，由Brunauer-Emmett-Teller（BET）方程可分别计算得到材料的比表面积。如表1 所列，当目标分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶3∶30 时，得到的DINP-MIP 具有最大比表面积，为378.23m2/g，总孔容为0.597m3/g，远高于非印迹聚合物NIP，可为DINP 的吸附提供足够空间。同时，不同配比的DINP-MIP 和NIP 的堆积孔径主要分布在4nm左右。

表1 不同摩尔比的印迹聚合物DINP-MIP和非印迹聚合物NIP的孔性质参数

2.3 DINP-MIPs的结构与DINP的吸附性能关系

系列分子印迹聚合物DINP-MIPs 对目标分子DINP 的吸附性能见表1。室温下，针对DINP 初始浓度C0为3×10-6μmol/L的模拟油中，吸附量按照目标分子、功能单体、交联剂摩尔比的关系依次为(1∶3∶30)＞(1∶3∶20)＞(1∶4∶30)＞(1∶4∶20)。其中1∶3∶30-DINP-MIP 对DINP 的吸附量最大达到0.55mg/g，与其比表面积最大结果一致。值得注意的是，尽管1∶4∶30-DINP-MIP的比表面积大于1∶3∶20-DINP-MIP，但是其吸附量分别为0.46mg/g 和0.49mg/g，表明合成过程印迹分子含量越多，形成的识别空腔越多，吸附量越大。理论上，1分子的目标分子DINP存在2个作用位点可以分别与α-MAA作用，构成由范德华力结合在一起的配合物。但实际聚合反应过程中，部分功能单体还会与交联剂进行共聚，且功能单体含量过多时可能还会造成单体的自聚合，进而导致单体与目标分子结合能力变差，所以目标分子与功能单体摩尔比为1∶3为最佳摩尔比，此时功能单体和交联剂以及目标分子结合制备的聚合物对目标分子DINP的结合能力最强。同理，在反应聚合过程中，交联剂起着连接各个功能单体形成网络状结构的作用。所以在合成过程中当交联剂不足时，无法形成一定交联度的聚合物。反之，则会导致合成的聚合物刚性较强，目标分子嵌入聚合物更深，后期洗脱困难。对比两组不同功能单体配比的DINP-MIP吸附性能，均表明目标分子和交联剂比例为1∶30具有更高的吸附量，从而最终确认目标分子和功能单体以及交联剂的最佳摩尔比为1∶3∶30，并简单标记为DINP-MIP，后期的传感器及检测研究均根据此配比下得到的分子印迹聚合物。

DINP-MIP 和NIP 对目标分子DINP 的吸附热力学分析如图4(a)所示。当DINP 处于低浓度时，DINP-MIP 和NIP 对DINP 的吸附量迅速增加，并随着DINP 的浓度不断增加，趋于达到饱和状态。DINP-MIP 对DINP 的吸附量明显高于NIP。为了进一步说明聚合物对DINP 的吸附行为，采用Langmuir 模型［式(3)］对吸附等温线进行拟合，结果如图4(b)所示。拟合标准方差R2均大于0.99，表明两者吸附均符合Langmuir 模型，根据拟合曲线关系斜率计算出最大吸附量分别为8.61mg/g 和4.00mg/g，MIP的吸附量是NIP的2倍以上，表明分子印迹聚合物具有显著的目标分子识别能力。

2.4 DINP-MIP/SPE电传感器对DINP的识别

在商品化的丝网印刷电极上修饰了分子印迹聚合物DINP-MIP，如图5(a)内插图所示，获得DINP-MIP/SPE 电传感器，并组装成三电极系统用于检测目标分子DINP。DINP-MIP/SPE、NIP/SPE和空白SPE 传感器的CV 和交流阻抗（EIS）如图5所示。结果表明，与未修饰的裸电极SPE 曲线相比，NIP/SPE 和DINP-MIP/SPE 曲线上的氧化还原峰明显增强。其原因在于DINP-MIP具有丰富的孔道，为[Fe(CN)6]3-/4-探针分子的扩散提供孔道，DINP-MIP/SPE 比NIP/SPE 曲线中的氧化还原峰值电流响应更强烈。

图5 在5mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中，不同电极的电化学相关性能

EIS 曲线进一步证明了电极表面状态的变化。如图5(b)所示，电荷转移电阻（Rct）在高频处形成较完整的半圆形；在低频时则为线性关系，对应于电子的扩散过程。其中裸电极SPE在高频处的半圆直径最大，这也说明裸电极SPE对[Fe(CN)6]3-/4-有较大的电子转移阻抗，故而其电流响应最低。而分子印迹膜修饰电极DINP-MIP/SPE 的直径相对应的最小，说明分子印迹敏感膜对[Fe(CN)6]3-/4-有较小的电子转移阻抗，与CV曲线结果相一致。

DINP-MIP/SPE 对不同DINP 浓度溶液的CV 曲线如图6(a)所示，以空白溶液的CV 曲线对应的氧化峰电流为基准，各CV 曲线对应的氧化峰电流与基准的差值ΔI随DINP浓度c变化如图6(a)内插图所示。在DINP 浓度为0.05×10-6～0.7×10-6mol/L 范围内，ΔI随c变化呈现高度线性相关，由此得到线性标准曲线为ΔI=65.172c+126.82（R2=0.992），表明随着DINP 浓度的增大，电极表面修饰的DINPMIP中更多的腔穴被目标分子DINP所占据，阻碍了K3[Fe(CN)6]探针分子的有效扩散，导致电流降低，即氧化峰电流与基准的差值ΔI越来越大。根据式(5)计算得到SD=4.772，由此确定DINP-MIP修饰电化学传感器的最低检测限（LOD）为0.117mg/kg。因此，最低检出限和线性范围均表明DINP-MIP/SPE电化学传感器对目标分子DINP具有高灵敏响应性。

图6 MIP和NIP对各类塑化剂的电化学响应对比图

进一步，选择DINP 同系物邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）和邻苯二甲酸二乙基己基酯（DEHP）等塑化剂，考察DINP-MIP/SPE 电化学传感器对其他多种PAEs 的响应性。如图6(b)所示，DINP-MIP/SPE对目标分子DINP 的响应峰电流变化最为明显，而对同系物也产生一定的吸附，氧化峰电流变化值ΔI分别为DINP（138.89mA）＞DEHP（89.39mA）＞BBP（65.59mA），这可能是因为PAEs 同系物分子结构中含有与印迹腔穴所匹配的功能基团。作为对比，由于NIP/SPE电极缺乏吸附位点，对各种塑化剂测试的峰电流变化ΔI在36～56mA 范围内比较相似。根据式(4)计算得到的DINP-MIP/SPE 对各种PAEs 的印迹因子IF 表明，DINP 的IF 最高为2.49，大于其他同系干扰物DEHP（2.05）和BBP（1.85），因此，以DINP 目标分子获得的分子印迹电化学传感器具有高响应性和广谱性。

2.5 食用油的检测应用

当在食用油中分别加入0.10μmol/L、0.30μmol/L、0.50μmol/L 的DINP，分别经乙腈和正己烷混合溶液萃取后，DINP-MIP/SPE 在定容的萃取液吸附后的CV 电流变化明显，如图7 所示，电流响应值与加标浓度呈正相关。平行操作测试3次后计算的空白加标回收率见表2。空白加标回收率为104.9%～106.6%，计算标准偏差RSD为4%～6%，说明DINPMIP/SPE修饰电化学传感器能够在实际样品中检测DINP，具有较高灵敏度和准确性，为现场快速定性分析食用油品中塑化剂的含量提供了可靠而便捷的方案。

表2 食用油中DINP的空白加标回收率

图7 不同DINP添加浓度的DINP-MIP修饰电极对实际油样品的CV响应曲线

3 结论

基于筛选获得的DINP-MIP 分子印迹聚合物，构建了一种快速检测DINP 的分子印迹电化学传感器DINP-MIP/SPE。DINP-MIP 分子印迹聚合物具有丰富的介孔和大孔，比表面积达到378m2/g，为DINP 吸附和扩散提供大量腔穴活性位点和孔道，对DINP 的饱和吸附容量为8.61mg/g，是非分子印迹聚合物NIP 的2 倍以上。DINP-MIP/SPE 电化学传感器对DINP 具有优异的灵敏度，印迹因子IF=2.49。线性检测范围0.5×10-7～0.7×10-6mol/L，最低检出限LOD=0.117mg/kg，远低于国家对DINP 限量标准（9mg/kg）。DINP-MIP/SPE电化学传感器对实际市售食用油中外加DINP 具有响应，空白加标回收率为104.9%～106.6%，标准偏差RSD 为4%～6%，说明此方法有较高的准确度并有望应用到食用油品塑化剂的快速检测。