固态发酵刺梨果渣改性膳食纤维工艺优化及结构特性分析

何兰兰，马四补，姜 特，梁文娟，晋海军，张丽艳

（贵州中医药大学，贵州贵阳 550025）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）学名缫丝花，又称送春归，为蔷薇科蔷薇属植物[1]，主要分布于我国贵州、云南，海拔500～2500 m 的向阳山坡、沟谷、灌木丛的热带及亚热带地区[2]。刺梨为贵州省的优势资源，据2021 年报道，全省人工种植面积约156 万亩，年产鲜果50 万吨，产值达100 亿元[3]。目前，刺梨相关产品的开发主要以刺梨汁为原料，榨汁后可产生大量果渣副产物，保守估计贵州省每年产刺梨果渣超过2 万吨[4]。刺梨果渣易发霉、腐烂，不易保存，会造成环境污染。

刺梨果渣中含有较多的功能性成分，如膳食纤维（dietary fiber，DF）、维生素C 和黄酮类等，其中膳食纤维的含量高达70%以上[4]。膳食纤维是继糖类、脂类、蛋白质、矿物质、维生素和水之后的“第七大营养物质”，据其溶解度不同，分为不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）。IDF 可减少排泄物在肠道的驻留时间，具有促进润肠排便的功效[5]；SDF 具有降低血脂水平，降低血压，改善血糖控制，减轻体重，改善免疫功能和减少炎症等作用[6]。前人对刺梨果渣中膳食纤维提取工艺做过一些研究，但大多以SDF 为评价指标，而刺梨果渣中IDF 和SDF对人体均具有一定的有益功效，对植物材料中膳食纤维科学的评价指标应为SDF/IDF。郭京京等[7]和Zhang 等[8]均以SDF/IDF 为评价指标，分别对沙棘渣、银耳中膳食纤维做出科学评价。本课题组前期研究发现刺梨果渣中SDF 含量较低，不利于其果渣资源的二次开发利用[3]。营养学家认为，提高SDF 在DF 中的比例，可增强膳食纤维的功效[9]。根据膳食纤维的功能和结构特点，采用化学法、酶解法、化学-酶结合法、微生物发酵法等方法可提高SDF 含量。其中微生物发酵法具有反应条件温和、污染少、易处理等优点，其又可分为液态发酵与固态发酵，发酵刺梨果渣大多采用微生物液态发酵法，未见固态发酵[2]。微生物固态发酵相较于液态发酵具有水分活度低、易生长、酶活力高、发酵过程无需严格无菌、成本低、易操作、可产生特殊风味、提高营养价值等优点[10]。

本文以SDF/IDF 为响应值，筛选刺梨果渣微生物固态发酵发酵优势菌种，采用响应面法对发酵工艺进行优化，以期获得最佳发酵工艺；通过持水性、持油性及膨胀力，分析发酵前后DF 理化性质的改变；利用扫描电镜、傅里叶红外光谱及X-射线分析发酵前后DF 结构变化。本文旨在提高刺梨果渣SDF/IDF，改善DF 理化性质及结构特性，为今后开发刺梨果渣副产品，提高其资源的利用率，减少资源浪费提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜刺梨果渣 国药集团同济堂（贵州）制药有限公司提供；发酵菌种（枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝）中国工业微生物菌种保藏管理中心；耐高温α-淀粉酶（酶活力≥4×104U/g）、糖苷酶（酶活力≥1.0×105U/g）北京索莱宝科技有限公司；酸洗硅藻土上海麦克林生化科技股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

XS205 型电子天平 瑞士梅特勒公司；L-600 型离心机 湘仪离心机有限公司；UV2510PC 型紫外分光光度 岛津企业管理（中国）有限公司；D8 Advance 粉末X 射线衍射仪 布鲁克（北京）科技有限公司；Nicolet iS50 FT-IR 傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Fisher 公司；日本高分辨冷场发射扫描电镜日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 刺梨果渣固态发酵菌种筛选

1.2.1.1 培养基的配制 MRS 培养基、PDA 培养基、麦芽汁琼脂培养基、乳酸菌培养基、查氏琼脂培养基等均按照菌种说明书配制。

1.2.1.2 菌种的活化及扩大培养 将从中国工业菌种保藏管理中心购买的菌株枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝按照相关说明进行活化处理，然后将活化的菌种转接至2～3 代恢复活力。

1.2.1.3 种子液的制备 将恢复活力后的菌株接种于液体摇瓶培养基中，按菌种说明书条件下培养，使其产生大量菌体，作为种子液。

1.2.1.4 刺梨果渣固态发酵菌种筛选 新鲜刺梨果渣：刺梨经国药集团同济堂（贵州）制药有限公司榨汁后得到的废弃物。

以新鲜刺梨果渣为培养基，选取食品发酵常用菌种枯草芽孢杆菌、绿色木霉、米曲霉、黑曲霉、植物乳杆菌、嗜热链球菌、平菇、灵芝分别进行单菌发酵，对比发酵后SDF/IDF，选取最优发酵菌种。

1.2.1.5 膳食纤维得率测定 参照郑佳欣[11]的酶-重量法，根据公式（1）～（4）测定膳食纤维（DF）、不溶性膳食纤维（IDF）、可溶性膳食纤维（SDF）得率。取干燥至恒重刺梨果渣1 g（m0），加入0.05 mol/L MESTRIS 缓冲液，磁力搅拌器使混合均匀。先后加入热稳定α-淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡萄糖苷酶酶解，过滤，将沉淀先后经70 ℃热水、78 %乙醇、95 %乙醇和丙酮洗涤2 次，烘干，即得m1（IDF）；上清液，加入4 倍体积95 %乙醇溶液（提前预热至60 ℃），室温下静置12 h，离心，收集沉淀，烘干，即得m2（SDF）。

1.2.2 刺梨果渣固态发酵工艺优化

1.2.2.1 单因素实验 接菌量对SDF/IDF 的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121℃灭菌30 min，发酵温度40 ℃，发酵时间4 d，考察发酵菌种接种量3%，6%，9%，12%，15%对SDF/IDF 的影响。

发酵温度对SDF/IDF 的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃灭菌30 min，发酵接菌量6%，发酵时间4 d，分别考察发酵温度25、30、35、40、45 ℃对SDF/IDF 的影响。

发酵时间对SDF/IDF 的影响：每个发酵瓶中加入刺梨果渣20 g，121 ℃灭菌30 min，发酵接菌量6%，发酵温度40 ℃，分别考察发酵时间2、3、4、5、6 d 对SDF/IDF 的影响。

1.2.2.2 响应面试验优化发酵工艺 在单因素实验基础上，利用软件Design-Expert 8.0.6 进行Box-Behnken 试验，设计三因素三水平试验，以发酵时间（A）、发酵温度（B）、接菌量（C）为自变量，SDF/IDF 为响应值，优化发酵工艺，设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素水平Table 1 Factor levels of Box-Behnken experimental

1.2.3 膳食纤维理化性质分析

1.2.3.1 持水力的测定 取0.2 g 干燥DF，于15 mL离心管中，称其质量为m0，加入10 mL 蒸馏水，振荡摇匀，静置24 h，8000 r/min 离心10 min，弃掉上清液，称其质量为m1，根据下式计算持水力[12]：

1.2.3.2 膨胀力的测定 取0.25 g 干燥DF，于15 mL 试管中，记录体积为V0，加入10 mL 蒸馏水，振荡摇匀，静置24 h，记录其膨胀后体积V1，根据下式计算膨胀力[12]：

1.2.3.3 持油力的测定 取0.2 g 干燥DF，于离心管中，加入适量植物油，静置24 h，过滤，称湿质量（m1），根据下式计算持油力[12]：

1.2.4 膳食纤维的结构表征

1.2.4.1 电镜检测（SEM）将发酵前和发酵后的DF 干燥至质量恒定，取适量DF 于扫描电镜下观察其超微结构[9]。

1.2.4.2 傅里叶红外光谱分析（FT-IR）取适量DF 于研钵中，加入溴化钾，充分研磨，装入模具，制成薄片，放入仪器，分析扫描，扫描次数：32 次，分辨率：4 cm-1，扫描范围：500～4000 cm-1[13]。

1.2.4.3 X-射线衍射分析（XRD）取适量DF 于样品槽，用玻璃板压实样品，使表面平整，将载样板插入仪器测试底座，测试条件：加载电压40 kV，步宽0.02°，扫描速率4°/min，扫描角度10°～45°[14]。

1.3 数据处理

所有实验数据均平行测定3 次，采用SPSS 26.0 进行单因素方差分析，P＜0.05 表示具有统计学意义、Design Expert 8.0.6、Jade 进行数据处理与分析，采用Origin 2021 b 进行作图。

2 结果与分析

2.1 固态发酵菌种对刺梨果渣SDF/IDF 的影响

由图1 可知，除黑曲霉外，其余菌种发酵刺梨果渣后均可使SDF/IDF 的比值升高，其中经枯草芽孢杆菌、米曲霉发酵后，SDF/IDF 显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），说明枯草芽孢杆菌、米曲霉对刺梨果渣膳食纤维有较好的改性作用，且枯草芽孢杆菌的作用效果最显著，因此本研究选取枯草芽孢杆菌为固态发酵菌种。枯草芽孢杆菌具有生长温度范围宽、发酵时间短、菌体自身可合成纤维素酶等优势。张智等[15]采用甘蔗渣制备膳食纤维时，也以枯草芽孢杆菌为发酵菌种，提高了可溶性膳食纤维的得率，同时改善了膳食纤维的结构及理化性质。

图1 不同菌种对刺梨果渣SDF/IDF 的影响Fig.1 Effect of different bacterial strains on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.2 单因素实验结果

2.2.1 接菌量对SDF/IDF 的影响 由图2 可知，SDF/IDF 随着接种量的增加呈先上升后下降趋势，下降后趋于平缓。当接菌量为6%时，SDF/IDF 达到最高为14.71%。当接菌量低于6%时，可能由于菌种量较少导致发酵不彻底，不能将植物细胞壁的致密结构完全破坏，使得SDF 的积累量较少；当接菌量高于6%时，SDF/IDF 呈下降趋势，可能是因为接种量过大，使得菌种生长繁殖旺盛，导致底物营养物质供应不足，开始逐渐消耗积累的SDF，造成SDF/IDF 下降[16-17]。

图2 接菌量对刺梨果渣SDF/IDF 的影响Fig.2 Effect of bacterial inoculation on SDF/IDFof Rosa roxburghii pomace

2.2.2 发酵温度对SDF/IDF 的影响 由图3 可知，随发酵温度的增加SDF/IDF 呈先上升后下降趋势。发酵温度为40 °C时，SDF/IDF 达14.58%。当发酵温度低于40 °C时，可能是因为环境温度达不到菌种适宜生长温度，生长代谢较慢，产生纤维素酶较少，导致SDF 积累量少，使得SDF/IDF 降低；当发酵温度超过40 ℃时，可能培养基中水分挥发较快，水分减少，影响菌种的生长，或者由于超过菌种适宜的生长温度，在一定程度上抑制菌种的生长以及纤维素酶的活性[18]，使得SDF/IDF 降低，故最佳发酵温度为40 ℃。

图3 温度对刺梨果渣SDF/IDF 的影响Fig.3 Effect of temperature on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.2.3 发酵时间对SDF/IDF 的影响 由图4 可知，随着发酵时间的延长，SDF/IDF 先上升后下降。发

图4 发酵时间对刺梨果渣SDF/IDF 的影响Fig.4 Effect of fermentation time on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

酵时间为4 d 时SDF/IDF 达14.92%。当发酵时间小于4 d 时，可能是因为发酵时间过短，菌种数量较少，发酵不完全，也可能是因为发酵时间过短不利于纤维素酶的合成；当发酵时间高于4 d 时，可能是因为生成了一些不利于菌体生长的物质，致使菌种活性降低，产生酶减少，也可能是生长到一定阶段后，基质被消耗，培养基中的养分不足以维持其生长，生成的SDF 被分解成糖类[19]，进而使其SDF/IDF 降低，故最佳发酵时间选择为4 d。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果 在单因素实验的基础上，运用Box-Behnken 试验设计原理，以接种量、发酵温度、发酵时间为自变量，以SDF/IDF 为响应值，进行三因素三水平试验，结果见表2。以Design Expert 8.0.6 对数据进行分析，得到A、B、C 与Y 二次回归方程：Y=14.32+0.005A+0.46B+0.33C-0.31AB+0.66AC-0.81BC-1.25A2-1.37B2-0.41C2。由 表3 可知，P=0.0033＜0.01，说明模型极显著。失拟项P=0.0767＞0.05，失拟项不显著，表明该模型拟合度较好。模型的决定系数R2=0.9261，调整决定系数R2adj=0.8310，表明该模型试验值与预测值间相关性较高，有83.10%实际数据能用于模型解释；F值越大，反映因素对响应值的影响越大，由此可知各因素对刺梨果渣中SDF 与IDF 的比值影响大小次序为发酵温度（B）＞接种量（C）＞时间（A）；一次项B 差异显著（P=0.0411＜0.05），A（P=0.9791）和C（P=0.1181）差异不显著（P＞0.05）；交互项AB（P=0.2773＞0.05）差异不显著、AC（P=0.0399）、BC（P=0.0172）均差异显著（P＜0.05）；二次项A2（P=0.0017）和B2（P=0.001）差异极显著（P＜0.01），C2（P=0.1481＞0.05）差异不显著。

表2 Box-Behnken 试验与响应值结果Table 2 Results of Box-Behnken test and response values

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.3.2 响应曲面分析 表3 显示，FAB＜FAC＜FBC，根据F值可知发酵时间与温度的交互作用对刺梨果渣SDF/IDF 的干扰最小，而接菌量与温度的交互作用对刺梨果渣SDF/IDF 的干扰最大。在响应面图中，等高线的形状为圆形时表示各因素之间的交互作用不显著，若为椭圆形则表示交互作用显著[20]。图5是各因素之间交互作用的三维响应面图和等高线图，AB 等高线形状为圆形，应曲面坡度不大，说明两因素间交互作用对刺梨果渣中SDF/IDF 的影响显著性不大；从AC 等高线图得知，等高线为椭圆形，表明两者的交互作用显著，沿发酵时间轴向等高线的变化密集，沿接菌量轴向等高线的变化稀疏，说明时间比接菌量更能影响刺梨果渣SDF/IDF；BC 等高线图近似椭圆形表明两者的交互作用显著，从等高线图得知，沿接菌量轴向等高线的变化密集，沿发酵温度轴向等高线的变化稀疏，说明接菌量比发酵温度更能影响SDF/IDF。

图5 各因素交互作用对刺梨果渣 SDF/IDF 影响的响应面图Fig.5 Response surface graph of the interaction of various factors on SDF/IDF of Rosa roxburghii pomace

2.4 最佳提取条件的预测和验证

经Design-Expert 8.0.6 软件分析，最佳发酵工艺为：发酵时间4.13 d，发酵温度40.03 ℃，接菌量7.48%。从实际操作角度考虑，对最佳发酵条件调整为：发酵时间4 d，发酵温度40 ℃，接菌量7.5%。验证试验测得刺梨果渣SDF/IDF 为14.21%±0.42%；说明此响应面法优化得到的刺梨果渣发酵工艺准确可靠。

2.5 刺梨果渣发酵前后膳食纤维理化性质分析

由表4 可知，发酵后刺梨果渣的膳食纤维持水力、持油力及膨胀力均高于未发酵组，表明发酵后刺梨果渣膳食纤维的理化性质发生了改变，在持水、持油及膨胀性方面都有所提升。此结果与Wang 等[13]的报道相似，这可能与膳食纤维结构改善有关，发酵后膳食纤维结构变得疏松，比表面积增大，使得纤维素与半纤维素中暴露出更多的亲水基团，产生SDF比例增多，持水性增强，同时改善其膨胀性[21-22]。

表4 发酵前后刺梨果渣DF 理化分析Table 4 DF physicochemical analysis of Rosa roxburghii pomace before and after fermentation

2.6 刺梨果渣发酵前后膳食纤维结构表征

2.6.1 扫描电子显微镜分析 如图6 所示，在相同倍率下对比刺梨果渣发酵前后显微图，UF-DF 表面光滑，有少量褶皱，呈现致密、规则结构；F-DF 表面出现裂纹，比表面积增大，有颗粒物附着且结构较疏松，呈片状可能是由于发酵产生了纤维素酶并对纤维素进行了降解，改善了微观结构，疏松的结构有利于膳食纤维样品的水化和提高其吸附性能，因此，推测FDF 结构的改变，是导致其持水力、持油力和膨胀力增加的主要原因[23-26]。

图6 刺梨果渣膳食纤维扫描电子显微镜图Fig.6 Scanning electron microscopy images of dietary fiber from Rosa roxburghii pomace

2.6.2 傅立叶红外光谱分析 由图7 可知，发酵前后DF 在吸收峰上没有明显变化，仅在吸收强度上存在微小差异，3423 cm-1处出现的吸收峰，可能是由于半纤维素和纤维素-OH 基团的振动引起，氢键在分子间形成，F-DF 在此处吸收强度比UF-DF 强，说明经过发酵处理DF 糖苷键断裂，合成氢键的羟基增多，导致内部缔合的氢键较多[6]。2922 cm-1出现较弱吸收峰，表明-CH 和-CH2基团存在，是纤维素的典型结构[27]。1739 cm-1处出现的峰可能是醛或酯中C=O 的特征峰，半纤维素的乙酰基和糖醛酸酯基的伸展。1603 cm-1处出现的峰可能是羰基吸收峰，由C=O 键伸缩振动引起，表明其中可能存在糖醛酸[28]。1246～1427 cm-1处的峰与C-H 的变角振动有关，说明样品中可能含有木质素，发酵后DF 吸收强度减小，这表明可能发酵后DF 中木质素含量减少[29]。1035 cm-1的峰是C-O 的伸缩振动，通常报道为阿拉伯糖和木聚糖[13]。综上，F-DF 的红外谱图相较于UF-DF 都有特征吸收峰，仅有部分波长对应吸收强度的差异，表明官能团基本相似，并未产生新的官能团，它们的亲水性基团和其他活性基团在发酵过程中没有发生变化。

图7 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维傅里叶红外光谱图Fig.7 Fourier transform infrared spectroscopy of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) ofRosa roxburghii pomace

2.6.3 X 射线衍射分析 纤维素晶体结构分为纤维素I-V 5 种结晶构型[30]。图8 为刺梨果渣 DF 发酵前后的XRD 图，可以看出2θ在15.34°和22.09°时有明显的结晶衍射峰，且在34.65°处有一个较弱的衍射峰，是纤维素I 的典型晶体构型[31]，发酵前后膳食纤维衍射峰的位置没有改变，只有衍射强度差异，这表明发酵并未使膳食纤维的结晶构型发生显著性改变。经Jade 7.0 软件拟合后发现，F-DF 相对结晶度为28.25%，UF-DF 相对结晶度为36.83%，相对结晶度降低了8.58%，说明发酵处理使纤维素和半纤维素发生降解，破坏了晶体结构，导致结晶度减小[32]；聚合力降低，使这些结构组分溶出或转化为水溶性成分溶出，导致刺梨果渣DF 的功能特性的变化[16]。

图8 发酵前（UF-DF）和发酵后（F-DF）刺梨果渣膳食纤维X-射线衍射光谱Fig.8 X-ray diffraction spectra of dietary fiber before fermentation (UF-DF) and after fermentation (F-DF) ofRosa roxburghii pomace

3 结论

本研究以刺梨果渣为原料，以枯草芽孢杆菌为菌种进行固态发酵改性膳食纤维，设计单因素实验与响应面法优化发酵工艺，研究发酵时间、温度及接菌量对SDF 与IDF 的比值影响，得出刺梨果渣最佳发酵工艺为：发酵时间4 d，发酵温度40 ℃，接菌量为7.5%，该条件下SDF 与IDF 的比值为14.21%±0.42%；分析发酵前后膳食纤维理化性质，发现刺梨果渣发酵后膳食纤维持水力、持油力及膨胀力有所提高；对发酵前后膳食纤维进行扫描电镜、红外光谱及X-射线衍射分析，电子扫描电镜结果显示，发酵后DF 结构疏松，表面有颗粒附着，比表面积增大，呈片状，表明发酵处理使刺梨果渣膳食纤维结构发生改变；在发酵前后FT-IR 谱图中没有出现新的峰，也没有出现明显峰的位置与数目变化，这表明并未产生新的化学基团，谱图中只存在强度的微小差异，说明是分子内基团数目有所变化，其中1427 cm-1处吸收强度减弱，因此，推测发酵使得刺梨果渣中木质素减少；XRD 测定发现，发酵并未改变刺梨果渣I 型纤维素的晶体特征，但相比发酵前相对结晶度减弱，这可能是原料中纤维素发生降解，纤维的结晶区和非结晶区被破坏所导致。因此，刺梨果渣经枯草芽孢杆菌固态发酵后，可使SDF/IDF 升高，且改善了膳食纤维的理化性质及结构特性。

发酵后刺梨果渣膳食纤维持水力、持油力、膨胀力增强，饱腹感增加；结构疏松，入口更加柔软，促进肠道蠕动，使其成为优质膳食纤维的制备原料，可提高刺梨果渣的利用率，为刺梨果渣的有效利用提供了依据，减少了资源浪费。本研究用单一菌种枯草芽孢杆菌发酵刺梨果渣来改性膳食纤维，但并未研究多菌种混合发酵，有待进一步研究混合菌种发酵对SDF/IDF 的影响；除研究刺梨果渣发酵后膳食纤维变化情况外，今后还应对维生素C、黄酮、SOD 等成分的变化进行分析，以期对发酵后的刺梨果渣资源进行科学评价。