橘皮精油/壳聚糖复合涂膜的制备及其对鲜切苹果保鲜性能的研究

闫文婧，张安怡，谭树良，何 其，何志妮

（南方医科大学 公共卫生学院，广州 510515）

0 引言

功能性生物高分子聚合物作为石油化工塑料的替代材料［1］，引起越来越多的关注。在不同的生物聚合物中，壳聚糖（CH）是甲壳素脱乙酰基后得到的一种无毒、生物可降解的多糖，具有成膜性和抗菌性，被广泛应用于食品保鲜涂层［2］。然而，由于分子间的强氢键作用，高分子质量的CH不溶于水，在一定程度上限制其广泛应用。同时，大量研究需要涂层拥有更显著的抗菌和抗氧化性能，就要求对CH 进行改性，提高其溶解度，同时改善其综合性能。

壳聚糖具有阳离子特性［3］。一些易产生阴离子的酸性成分，可以作为CH 的添加物，改善其性能。一些具有弱酸性、抗菌和抗氧化活性的植物提取物，被广泛应用于CH 复合材料的开发中，显示出广阔的应用前景［4］。

橘皮精油（TPEOs）是柑橘类水果的重要提取物，主要成分是柠檬烯，具有解热、镇痛、抗病毒、抑菌和抗氧化等多种生理功能［5］，受到广泛关注［6］。

本文分别从3种不同种类的柑橘：椪柑（Citrus reticulata，CR）、苦橙（Citrus bigarradia，CB）和甜橙（Citrus sinensis，CS）中提取精油，作为CH 材料的功能性添加物，用于鲜切苹果的保鲜。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

柑橘［CR，CB 和CS，重量（146±27）g］和苹果［重量（239±33）g］购自当地市场，果实色泽饱满，无明显缺陷和腐烂；壳聚糖（脱乙酰度为75%～85%，CAS 9012-76-4），美国生命科学与高科技集团公司；所有其他试剂，中国生工生物技术有限公司。所有化学品都是分析级。

1.2 主要仪器设备

Clevenger 型蒸馏仪（北京科思佳有限公司）；6890-5975 型GC-MS 联用仪（美国安捷伦科技公司）；Vector 33 型傅里叶红外分析仪（德国布鲁克公司）；Nova Nano 3700 型扫描电子显微镜（美国FEI 公司）；CR-300 型色度计（美国柯尼卡美能达公司）；293-230-30 型手持式数字千分尺（日本三丰公司）；UV-1800 型分光光度计（日本岛津公司）；Brookfield-CT3 型质构分析仪（美国布鲁克菲尔德公司）。

1.3 方法

1.3.1 TPEOs 提取和成分分析

柑橘橘皮在50 ℃的对流炉中干燥48 h，切碎，用蒸馏仪进行水蒸气提取6 h，收集TPEOs。在硫酸氢钠上干燥24 h，过滤，并于4 ℃储存在棕色密封玻璃瓶中，直到测试。

采用QI 等［7］的方法，用联用仪对TPEOs 的主要成分进行定量分析，系统采用HP-5 MS 熔融石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm 膜厚）。TPEOs 的主要成分使用Kovats 指数进行鉴定。

1.3.2 CH-TPEOs 薄膜的制备和微观结构分析

参考NOSHIRVANI 等［8］的研究，取1 g CH完全溶解在100 mL 体积分数为1%的乙酸水溶液中，在60 ℃搅拌4 h。将混合溶液分成4 组，其中3 组分别加入3 种不同的TPEOs，在60 ℃搅拌3 h；随后超声波处理（200 W，40 kHz）30 min。将得到的溶液涂布在无机玻璃板上（36 cm×24 cm），在60 ℃干燥12 h，制备薄膜，4 种制得的薄膜分别记为CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS。

用液氮对所制备的薄膜进行低温断裂处理并喷金。使用扫描电子显微镜观察薄膜的表面和截面微观结构。

使用色度计测定薄膜的颜色参数。结果以L*（亮度）、a*（红、绿）和b*（黄、蓝）表示。

1.3.3 薄膜的抗氧化和抗菌活性

使用HE 等［9］的方法，通过2，2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）和2，2-叠氮基（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）酸自由基（ABTS+）的清除能力测定CH-TPEOs 的抗氧化活性。将DPPH（0.1 mmol/L）溶解在甲醇中制备DPPH 溶液。将等体积的ABTS（2 mmol/L）和高硫酸钾（2.45 mmol/L）混合制备ABTS+溶液。将0.2 g CH-TPEOs 均质于3.0 mL 甲醇中，离心作用取上清液，根据其在分光光度计517，734 nm 处吸光度计算抗氧化性。

使用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌，测定CH-TPEOs 膜的体外抗菌活性。制备每种测试微生物悬浮液（～100 CFU/mL），并在MH 固体培养基板上扩散。将CH-TPEOs 膜的圆盘（6 mm）放置在接种板上，在37 ℃培养24 h。

1.3.4 CH-TPEOs 涂层在鲜切苹果表面的形成

苹果去皮、去核，切成边长约2 cm 的方块，浸泡在200 mg/kg 的次氯酸钠溶液中消毒2 min，后用蒸馏水清洗氯残留。苹果样本分成5 组，其中，对照组在储藏前不作涂膜处理。CH-O，CH-CR，CH-CB 和CH-CS 组分别用相应的CH 材料涂膜（约60 µm 厚度）。所有处理后的苹果在（1±0.3）℃储存16 d，每隔4 d 取样评估苹果的贮藏品质。

1.3.5 贮藏苹果的感官特性

苹果的感官评价由实验室10 名训练有素的工作人员（5 女5 男，年龄20～50 岁）完成。样品随机抽取，用5 分制（0 分代表拒绝，5 分代表非常新鲜）对苹果的颜色、气味、质地、味道和一般可接受度进行评分。

苹果的硬度由配备有6 mm 圆柱形探针和Brookfield 分析软件的质构分析仪测试。采用5 mm/s 的测试速度，5 g 的触发载荷和2 次5 mm的压缩，间隔时间为5 s。

苹果的表面颜色根据上文中描述的方法进行测量。

1.3.6 贮藏苹果的微生物分析

在整个储藏过程中，苹果的菌落总数（TBC）和厌氧菌落总数（TAC）采用HE 等［10］的方法进行测定。样本提取物分别在含有10 g/L 氯化钠的铁琼脂平板和平板计数琼脂板上15 ℃培养3 d后，测定TBC 和TAC。

1.3.7 鲜切苹果在储藏期间的化学分析

根据ZHANG 等［11］的方法，对贮藏苹果中的花青素含量进行测定。样品用乙醇和质量分数为15%的盐酸进行提取。用分光光度计在535 nm处测量的吸光度计算结果。

用IBRAHIM 等［12］的方法，测定贮藏苹果中的叶绿素α，β和类胡萝卜素的含量。样品用丙酮处理。叶绿素α，β和类胡萝卜素的含量分别用分光光度计上440，644，662 nm 的吸光度值计算。

1.4 统计分析

每个试验使用不同的样本至少重复3 次。数据以平均值±标准差（SD）表示。采用SPSS 17.0进行多重比较，采用Duncan 检验和单因素方差分析（ANOVA）。如果p＜0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果和讨论

2.1 TPEOs 中的成分分析

水蒸馏后得到3 种TPEOs，分别标识为CR-T，CB-T，CS-T。如表1 所示，精油中主要鉴定成分分别占总成分的92.02%，96.82%，95.02%，其中柠檬烯和γ-松油烯占总成分80%以上。

表1 TPEOs 中的主要效应组成Tab.1 Composition of main effects in the TPEOs

2.2 制备薄膜的微观结构分析

CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 的膜厚分别为（69±8），（71±5），（67±3），（70±7）µm，说明精油的添加没有显著影响薄膜的厚度［26］。同时，如图1 所示，不同膜之间没有显著的外观差异。

图1 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜表面轮廓的SEM 图Fig.1 SEM images of the surface contours of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

2.3 制备膜的抗氧化和抗菌活性

DPPH 和ABTS+都是评估样品抗氧化活性的常用方法［27］，虽然基于相同原理，但结果通常有差异，其原因可归因于侧链中双键通过共振稳定了DPPH 自由基的立体结构。

表2 揭示不同CH 膜的抗氧化活性。含有CS 精油的CH 膜具有更高的抗氧化性。这可能是由于CS 精油中萜类和烯类化合物含有双键，可通过加成-OH 形成二级基团，由此清除体系中的大部分-OH，从而达到抗氧化的目的。

表2 CH-O，CH-CR，CH-CB，CH-CS 膜的抗氧化和抗菌活性Tab.2 Antioxidant activity and antibacterial activity of CH-O，CH-CR，CH-CB and CH-CS films

TPEOs 的另一个值得注意的活性是抗菌能力。表2 同时显示对不同微生物种类的抑菌能力。在薄膜中加入TPEOs 后，其抗菌能力显著增加（p＜0.05），CH-CR 膜对不同微生物均具有最强的抗菌能力。这可能是由于CR-T 中的某些成分可以作用于微生物外膜上的蛋白质颗粒，抑制其功能，特别是葡萄糖等小亲水分子的被动转运功能，从而实现抗菌的目的。

2.4 CH-TPEOs 涂层的鲜切苹果的感官特性

感官特性可以简单而有效地评估保鲜食品材料的总体新鲜度。在贮藏开始时，苹果新鲜，颜色浅，组织牢固，气味清新。储藏过程中，苹果逐渐腐败，外观变暗，质地变软，气味变淡。如图3所示，所有样品的初始感官评分都接近5 分。经过12 d的贮藏，对照组的各种感官评分降低至2 分左右，而CH-O 涂层样品的数值保持在3 分左右。CHTPEOs 涂层样品仍然在4 分左右，表明CH-TPEOs涂层可以明显延缓苹果样品感官品质下降。

图3 CH-TPEOs 涂层保存的鲜切苹果样品的感官评价Fig.3 Sensory evaluation of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

图4 显示苹果样品的硬度变化。在整个贮藏期间，对照样品的硬度从15.5 g 下降到8.5 g，而涂有CH-TPEOs 的样品仍然保持在13～14 g。气候性水果收获后软化主要可归因于细胞壁的酶水解［28］，CH-TPEOs 涂层提供了一个弱酸性环境，可能会降低酶水解的活性。

图4 CH-TPEOs 涂层保存的鲜切苹果样品的硬度Fig.4 Hardness of fresh-cut apple samples preserved with CH-TPEOs coating

褐变是影响鲜切苹果销售的主要外部质量问题［29］。在贮藏期间，对照组出现明显的褐变，而涂膜组没有观察到明显的变化。如图5 所示，在整个贮藏过程中，所有样品的a*和b*值都呈现持续上升的趋势，而L*值的变化趋势持续下降，这些变化在涂膜样本中得到明显抑制。

图5 CH-TPEOs 涂层保存的鲜切苹果样品的表面颜色Fig.5 Surface color of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

2.5 CH-TPEOs 涂层的鲜切苹果的微生物特性和化学特性

图6 显示贮藏过程中苹果的TBC 和TAC 持续增加的趋势。

图6 CH-TPEOs 涂层保存的鲜切苹果样品的微生物计数Fig.6 Microbial counts of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

涂层减少了样品中的微生物数量。最初各组样品的TBC 和TAC 分别为2.9，2.1 log CFU/g。在整个贮藏过程中，对照组样品的TBC 和TAC 分别增加到7.6，5.4 log CFU/g，而CH-O 样品的相应数值分别增加到6.2，4.3 log CFU/g。同时，CHTPEOs 涂层组的TBC 仍保持在4.2～4.5 log CFU/g，TAC 仍保持在2.9～3.3 log CFU/g。TPEOs 对CH涂膜抗菌性增强的机制可以用Lewis 酸碱理论来描述。TPEOs 包括萜类化合物和多分子烯烃，因此TPEOs 在水中的溶解可以产生大量的H+作为电子受体，可以导致CH 中的正电荷密度增加，增强聚阳离子对带负电的菌体细胞膜的破坏，提高抗菌活性。

贮藏过程中，苹果化学性质的变化如图7所示。

图7 CH-TPEOs 涂层保存的鲜切苹果样品的化学性质Fig.7 Chemical properties of fresh-cut apple samples preserved by CH-TPEOs coating

如图7（a）所示，初始花青素为199 mg/kg。在贮藏过程中，所有样品中的花青素呈现先增加后下降的趋势，是由于细胞破裂后，细胞中的花青素释放出来，然后逐渐分解。这一过程在一定程度上被TPEOs 所抑制。

如图7（b）所示，所有样品中的类胡萝卜素初始含量为4.7 mg/g，在储存期间含量呈下降趋势。涂有CH-TPEOs 的苹果与对照组相比，下降幅度明显降低，是由于TPEOs 涂层可以抑制储藏期间胡萝卜素的分解。

图7（c）（d）揭示了样品中叶绿素α，β的上升趋势。对照组的叶绿素α（1.6～4.0 mg/g）和叶绿素β（3.0～13.7 mg/g）最高，CH-O 样品紧随其后，其叶绿素α在储藏期间增加到3.4 mg/g，叶绿素β增加到10.8 mg/g。CH-TPEOs 样品的叶绿素含量最低，叶绿素α，β分别增加到2.7，7.9 mg/g。

3 结语

通过橘皮精油改善壳聚糖的性能，用于保鲜鲜切苹果。结果显示，TPEOs 的引入没有使壳聚糖薄膜的微观图像发生明显的变化，但明显改变了膜的颜色参数，同时显著提升了膜的抗氧化和抗菌活性。CH-TPEOs 作为保鲜涂层显著抑制鲜切苹果的感官劣变，降低鲜切苹果样品中的微生物数量，使TBC 从7.6 log CFU/g 降至4.2～4.5 log CFU/g，使TAC 从5.4 log CFU/g 降至2.9～3.3 log CFU/g，并抑制花青素、胡萝卜素和叶绿素在贮藏过程中的变化。研究表明，CH-TPEOs 薄膜作为抗氧化剂和抗菌剂涂层在储藏鲜切食品方面具有广阔的发展潜力，为新型可食用包装材料开发提供借鉴，有着良好的应用前景。