miR-142-3p通过调控Hmgb1抑制雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J凋亡

苏拾香，王语阳，覃宗帅，黄桂香，徐 键，岑兰英，覃月秋*

1.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2.右江民族学院 研究生院，广西 百色 533000

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床常见的消化系统疾病,以严重炎性反应和腺泡细胞死亡为特征,该病起病急,进展快,部分可发展为重症急性胰腺炎,病死率高且预后差[1]。急性胰腺炎的发生发展和细胞凋亡密切相关[2],而微RNA(microRNA,miRNA)可通过直接调控其靶基因影响细胞凋亡,参与急性胰腺炎的发生和发展[3]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)可以通过调控细胞凋亡而参与胰腺损伤、炎性反应、肿瘤的发生发展过程[4]。研究发现,miR-142-3p靶向Hmgb1在一些疾病中调控细胞凋亡[5],但在急性胰腺炎中尚未见文献报道。本研究采用大鼠胰腺外分泌细胞AR42J细胞构建AP模型,以研究miR-142-3p靶向Hmgb1调控腺泡细胞凋亡的影响及机制,为治疗AP提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J和Ham′s F-12K培养基(上海澳睿赛生物技术有限公司);PBS、多聚赖氨酸、胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司);青-链霉素混合液、20×TBST、蛋白磷酸化酶抑制、PMSF、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司);雨蛙素(cerulein,纯度≥95.0%,上海源叶生物科技有限公司);细胞凋亡-Hoechst 33258染色试剂盒、QuickBlockWestern快速封闭液、彩虹 Marker (上海碧云天生物技术有限公司);RIPA裂解液(北京英文特生物技术有限公司);Caspase-3、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白(H+L)HRP、山羊抗小鼠 IgG(H+L)HRP (江苏亲科生物研究中心有限公司);Bax、HMGB1抗体(Abcam公司);质粒(上海吉玛制药技术有限公司);Bcl-2、10×SDS-PAGE 电泳缓冲液、10×Tris-Glycine 转膜缓冲液、PAGE 凝胶快速制备试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司);Trizol、 Lipofectamine3000(上海赛默飞世尔科技有限公司);PVDF 膜(Millpore公司);超敏 ECL 化学发光试剂盒(苏州莫纳生物科技有限公司);Opti-MEM (Gibco公司);MicroRNA第一链cDNA反转录试剂盒、SYBR Master Mix扩增试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司);RT-qPCR 引物(广州易锦生物技术有限公司);AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:将AR42J细胞分为空白组(blank),急性胰腺炎细胞模型组[6](AP,100 nmol/L雨蛙素作用24 h),造模24 h后细胞胞质内出现大量空泡。再分别用miR-142-3p mimics、 mimics NC、miR-142-3p inhibitor 和inhibitor NC转染模型组细胞6～8 h,记为miR-142-3p mimics组、 mimics NC组、miR-142-3p inhibitor组 和inhibitor NC组,继续培养24、48 h后用于试验检测。

1.2.2 RT-qPCR检测miR-142-3p表达:转染24 h后各组细胞加入1mL Trizol试剂提取细胞RNA,利用miRNA第一链cDNA反转录试剂盒合成cDNA。RT-qPCR反应条件为:预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 10 s, 退火56 ℃ 10 s,延伸72 ℃ 30 s,40个循环。以U6作为 miR-142-3p的内参,结果使用2-ΔΔCt法分析。各基因引物序列见表1。

1.2.3 Western blot检测HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白:转染48 h后收集各组细胞,用RIPA裂解液裂解细胞,收集上清液,用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。SDS-PAGE分离条件为80 V 30 min,120 V 70 min,常规湿法转膜后,快速封闭液封闭45 min, 各组分别加入各兔抗人HMGB1抗体(1∶1 000)、兔抗人 caspase-3抗体(1∶1 000)、鼠抗人 Bcl-2 抗体(1∶1 000)、兔抗人β-actin 抗体(1∶5 000) 4 ℃摇床孵育过夜,洗涤,IgG-HRP标记的羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)二抗室温摇床孵育2 h,洗涤, ECL显影。蛋白质条带使用Image J软件分析吸光度值。

1.2.4 Hoechst染色测定细胞凋亡:各组细胞接种于6孔板内,使其约为50%～80%汇合度。刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5 mL固定液,固定10 min或更长时间(可4℃过夜)。去固定液,用PBS洗涤。加入0.5mL Hoechst 33258染色液染色。去染色液,用PBS洗涤。滴抗荧光淬灭封片液。荧光显微镜观察。

1.2.5 流式细胞测量术测定各组细胞凋亡率:转染后24 h,制备各组重悬细胞,各组细胞按照annexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书操作,流式细胞仪上机检测。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系:构建Hmgb13′UTR-WT和Hmgb13′UTR-MUT的荧光素酶报告载体,分别与miR-142-3p mimics、miR-142-3p mimics NC共转染,按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作,转染48 h后收集细胞,比较各组相对荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞培养及转染

常规培养的AR42J细胞呈上皮细胞样,贴壁增殖,细胞增殖速度缓慢,有密度依赖,成片增殖(图1A)。雨蛙素刺激造模24 h后,细胞胞质内出现大量空泡,部分细胞变形,伪足增多(图1B)。转染后细胞松散,形态较圆,部分细胞可见脱落死亡(图1C)。

A.normal AR42J cells; B.24 hours after cerulein stimulation,vacuoles appeared in the cytoplasm, cell deformation, pseudopodia increased(white arrow);C.24 hours after transfection,cells were loose and round in shape, and some cells fell off and died(white arrow)图1 AR42J细胞培养和转染效果Fig 1 Cell culture and transfection effect for AR42J cells(×200)

2.2 各组细胞miR-142-3p的表达

与空白组相比,AP组的miR-142-3p表达水平显著下调(P<0.01);与mimics NC组相比,miR-142-3p mimics组miR-142-3p表达水平显著上调(P<0.01);与inhibitor NC组相比,miR-142-3p inhibitor组miR-142-3p表达水平下调(P<0.05)(图2)。

AP.acute pancreatitis; *P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC.图2 各组细胞miR-142-3p相对表达量Fig 2 Relative expression of miR-142-3p in each

2.3 各组细胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达

与空白组相比,AP组的HMGB1、caspase-3蛋白表达量上调(P<0.05)(图3A～B),Bax蛋白表达量显著上调(P<0.01)(图3C),Bcl-2蛋白表达量显著降低 (P<0.01)(图3D)。与mimics NC组相比,miR-142-3p mimics组HMGB、caspase-3、Bax蛋白表达量显著下调(P<0.01)(图3A～C),Bcl-2蛋白表达量上调(P<0.05)(图3D)。与inhibitor NC组相比,miR-142-3p inhibitor组HMGB1、caspase-3、Bax 蛋白表达量显著上调(P<0.01)(图3A～C),Bcl-2 蛋白表达量降低(P<0.05)(图3D)。

A.relative expression of HMGB1 protein in each group; B.relative expression of caspase-3 protein in each group; C.relative expression of Bax protein in each group; D.relative expression of Bcl-2 protein in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with blank or NC group; AP.acute pancreatitis.图3 各组细胞HMGB1、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达情况Fig 3 Expression of HMGB1, caspase-3, Bax and Bcl-2 protein in each

2.4 各组细胞凋亡情况

空白组正常细胞的细胞核呈正常的蓝色(图4A),与空白组相比,AP组细胞的细胞核呈致密浓染,部分颜色发白(图4B);与mimics NC对照组相比,miR-142-3p mimics组细胞核致密浓染较少(图4D);与inhibitor NC组相比转染miR-142-3p inhibitor后细胞核致密浓染增多(图4F)。二维散点图记录AR42J细胞凋亡, annexinV-APC为横坐标, 7-AAD为纵坐标, 以阴性对照设定正常界限, 将细胞分为: 正常活细胞(左下象限Q1-LL,annexinV-APC-、7-AAD-); 早期凋亡细胞(右下象限Q1-LR,annexin V-APC+、7-AAD-); 晚期凋亡和死亡细胞(右上象限Q1-UR,annexin V-APC+、7-AAD+)。与空白组相比,AP组早期凋亡细胞增多,凋亡率显著升高(P<0.01)(图5B);与mimics NC对照组相比,miR-142-3p mimics组早期细胞凋亡减少,凋亡率显著降低(P<0.01)(图5D);与inhibitor NC组相比,miR-142-3p inhibitor组早期细胞凋亡增多,凋亡率显著升高(P<0.01)(图5F)。

AP.acute pancreatitis;*P<0.01 compared with blank or NC.图5 流式细胞测量术检测各组AR42J细胞凋亡水平Fig 5 Level of apoptosis in each group of AR42J cells was detected by flow

2.5 miR-142-3p靶向调控Hmgb1的表达

Target Scan Human数据库显示HMGB1与hsa-miR-142-3p存在结合位点(图6)。为了进一步验证Hmgb1与miR-142-3p之间的互作关系,进行荧光素酶报告基因检测,实验结果显示Hmgb1与rno-miR-142-3p含有互补的核苷酸序列(图7);与转染miR-142-3p mimics NC+rno-Hmgb1-3′UTR-wt 相比,共转染rno-miR-142-3p mimics+rno-Hmgb1-3′UTR-wt的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。由此可见,miR-142-3p可靶向调控Hmgb1的表达(图8)。

图6 Target Scan Human数据库显示HMGB1与miR-142-3p的互作靶点Fig 6 Target Scan Human database shows the interaction target of HMGB1 and miR-142-3p

图7 Rno-miR-142-3p与r-Hmgb1-3′UTR靶位点结合示意图Fig 7 Binding of rno-miR-142-3p to rno-Hmgb1-3′UTR target site

3 讨论

急性胰腺炎是临床常见的消化系统疾病, 起病急,进展快, 大多数患者表现为轻症急性胰腺炎,呈自限性,但仍有20%发展为重症急性胰腺炎[7]。近来研究发现细胞凋亡与AP的发生、发展密切相关[2],在轻症急性胰腺炎中存在广泛的腺泡细胞凋亡,但在重症急性胰腺炎中则以腺泡细胞坏死为主[8]。

HGMB1通常作为损伤相关模式分子,是炎性反应、免疫和代谢反应的介质[9],近年研究发现HGMB1可通过调控细胞凋亡而参与胰腺损伤、炎性反应和肿瘤的发生发展过程[4]。经雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型、AR42J细胞炎性模型中,HGMB1、caspase-3、Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低[10-11]。急性胰腺炎患者血清中caspase-3水平升高[12]。本研究发现,与空白组相比,模型组HGMB1、caspase-3、Bax蛋白表达量升高,Bcl-2蛋白表达量下降,这与文献报道一致。

miR-142-3p作为一类小非编码RNA,在机体生理和病理过程中发挥着关键的调节作用[13]。研究发现,miR-142 模拟物靶向 TLR4/NF-kB 信号通路,促进Bcl-2表达,抑制caspase-3和Bax表达,从而抑制新生大鼠心肌细胞凋亡,保护小鼠心脏组织免受缺血/再灌注的侵害,从而改善心脏功能[14]。在实验性骨关节炎小鼠的关节软骨组织中,miR-142-3p表达水平下降,miR-142-3p的过表达靶向Hmgb1介导的 NF-kB 信号通路来抑制软骨细胞凋亡[15]。

上述研究表明,miR-142-3p与细胞凋亡及疾病进展密切相关,但是否靶向Hmgb1调控雨蛙素诱导的大鼠外分泌系细胞AR42J的凋亡尚不明确。本研究发现在AP组中miR-142-3p低表达,HGMB1、caspase-3、Bax表达上调,Bcl-2表达下调,细胞凋亡水平升高。上调miR-142-3p表达后,HGMB1、caspase-3、Bax表达下调,Bcl-2表达上调,细胞凋亡水平下降;而下调miR-142-3p表达可逆转上述结果。提示miR-142-3p可能通过HGMB1调控凋亡相关蛋白 caspase-3、Bax和Bcl-2的表达来调控急性胰腺炎AR42J细胞的凋亡。为明确miR-142-3p与Hmgb1靶向关系,本研究进行双荧光素酶基因实验,结果证实Hmgb1为miR-142-3p的靶基因。

综上所述,miR-142-3p通过靶向Hmgb1调控凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平,进而影响雨蛙素诱导的大鼠胰腺外分泌细胞系AR42J的凋亡,这为临床治疗AP提供新思路。