马里苷减轻糖尿病小鼠心肌纤维化

田亚婷，张 芳，张博翔，李 甜

新疆医科大学 基础医学院 组织学胚胎学教研室；新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以高血糖为特征的一个日益严重的慢性代谢性疾病[1]。糖尿病性心肌病(diabetic cardomyopathy,DCM)是继发于糖尿病的一种特异性心肌病,其独立于高血压性、冠状动脉粥样硬化性或其他原因所致心脏病[2]。糖尿病心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是糖尿病心肌病晚期的主要病理变化之一,是引起心室重塑的重要原因。心肌中过多的胶原(Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白)沉积会降低心脏顺应性,从而导致左心室硬度增加和收缩功能受损,最终导致心力衰竭[3]。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是细胞增殖、分化、伤口修复和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生研究最多和有效的调节剂之一[4]。相关研究表明,TGF-β1的上调与糖尿病心脏的纤维化有关,高葡萄糖可以增加TGF-β1活性,增加糖尿病大鼠心脏中的间质纤维化和细胞肥大[5]。在正常生理状态下,心脏中的TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量很低,但在高血糖、氧化应激、炎性反应等因素的刺激之下,体内的TGF-β1及其受体的表达会发生变化,使心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞进行分化,刺激胶原、纤维连接蛋白、蛋白多糖等物质的合成,活化的TGF-β1会进一步使细胞外基质沉积,从而加重心脏的纤维化[6]。

马里苷(marein)是从两色金鸡菊头状花序中分离得到,属于黄酮类化合物。有抑制糖尿病肾病的肾脏纤维化等作用[7]。经查阅,儿茶类化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可以通过调节TGF-β1通路对心肌纤维化产生影响[8],但马里苷是否通过调节TGF-β1影响糖尿病心肌纤维化还未见报道。因此,本课题拟采用马里苷干预糖尿病小鼠,观察糖尿病小鼠心脏纤维化的改变,从而为马里苷改善糖尿病心肌纤维化提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:5～6周龄自发性糖尿病SPF级db/db雄性小鼠和相同来源db/m雄性小鼠(江苏常州卡文思实验动物有限公司),饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级动物饲养室。在饲养小鼠时,所需用品都经过高温高压消毒,并且符合国际动物保护的有关准则和规则,合格证号:IACUC-20190226-20。

1.1.2 主要试剂:马里苷(Extrasynthese公司提供纯度99.9%);二甲双胍(metformin,Met)(MCE公司);基因引物序列(上海生工生物公司合成);兔抗fibronectin、vimentin抗体(Abcam公司);兔抗TGF-β(博奥森生物技术有限公司);兔抗GAPDH抗体(Affinity公司);蛋白质marker(10～180 ku)(Thermo Fisher Scientific公司);Masson染色试剂盒(Solarbio公司);苏木精染液(Biosharp公司)。

1.1.3 给药试剂的配置方法:

1)羧甲基纤维素钠溶液:称取羧甲基纤维素钠粉末0.0226 g,置于200 μL蒸馏水中,溶解后涡旋混匀,配成 2.5%的羧甲基纤维素钠溶液。

2)马里苷给药溶液:称取25 mg马里苷加入2.5 mL 2.5%羧甲基纤维素钠溶液中,配置成10 mg/mL的混悬液,以50 mg/kg标准进行小鼠灌胃给药。

3)二甲双胍给药溶液:称取0.53 g 二甲双胍加入8.9 mL 2.5%羧甲基纤维素钠溶液,以280 mg/kg标准进行小鼠灌胃给药。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组与药物干预:10只db/m雄性小鼠为对照组,将30只db/db鼠分成3组:10只db/db组,10只二甲双胍和10只马里苷阳性药干预组。根据前期课题组研究,计算出了二甲双胍和马里苷的适宜给药剂量,二甲双胍适宜给药剂量为每日灌胃280 mg/kg,马里苷适宜给药剂量为每日灌胃50 mg/kg。

1.2.2 样本收集:药物干预8周以后,所有的小鼠禁食12 h,不禁水,过夜,颈脉脱臼处死小鼠。心脏组织标本的收集:处死小鼠后,迅速取出其心脏,用眼科剪将心肌周围的脂肪组织和结缔组织去除,用0.9%氯化钠溶液冲洗干净,并用吸水纸吸干多余的水分。将心肌组织放在培养皿中,切取长约5 mm、横截面积约1 mm2的组织块,用4%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定,置于1.5 mL干净的冻存管-80 ℃保存。

1.2.3 HE染色观察心肌组织形态:用切片机将组织蜡块切成约5 μm厚度的切片。烤片、 脱蜡、梯度乙醇脱水。苏木精染色5 min,1%的乙醇溶液中分化5 s,1%氨水水溶液返蓝30 s,伊红染色液1 min,放入80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 s。封片、晾干,观察并采图。

1.2.4 Masson染色观察心肌组织形态:烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水。苏木精染色5 min。酸性乙醇分化液分化8 s。蓝化液返蓝、丽春红品红染色,弱酸工作液清洗,磷钼酸溶液洗1.5 min。滴加苯胺蓝1 min,用蒸馏水冲洗终止染色,加入弱酸工作液。95%乙醇脱水2 s,无水乙醇分化7 s×3次,二甲苯透明1 min×3次。封片、晾干,观察并采图。

1.2.5 免疫组织化学检测各心肌组织vimentin蛋白的表达水平:烤片、脱蜡、梯度乙醇脱水。用H2O2除去内源性过氧化物。磷酸盐缓冲液浸泡5 min×3次。高火煮沸5 min,冷却。血清37 ℃温箱封闭。一抗覆盖组织并放入4 ℃冰箱,过夜。 次日取出放置于室温,用磷酸盐缓冲液浸泡。二抗覆盖组织,室温孵育。磷酸盐缓冲液浸泡。 DAB显色、苏木精染色,乙醇溶液中浸泡2 s,磷酸盐缓冲液反蓝、脱水、透明、封片、观察并采图。

1.2.6 Western blot检测心肌组织纤连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、vimentin和TGF-β1蛋白的相对表达:取出在-80 ℃冰箱中保存的心肌组织,加入组织高效蛋白裂解液,在冰上放置30 min,匀浆、裂解并离心,取出上清液,丢弃沉淀,并将其放在冰上进行短期保存,或者将其放在-80 ℃的冰箱中进行长期保存。采用BCA法进行蛋白定量,进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭、敷一抗过夜。第2天,TBST冲洗、敷二抗、曝光、显影,进行数据分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色观察小鼠的心肌组织形态学改变

db/m组心肌组织结构清晰,细胞间质未增大,炎性细胞浸润不明显;db/db组心肌组织出现了明显的损害,心肌纤维肥大、肿胀、排列紊乱,部分心肌纤维断裂,细胞间质明显肿大,局部有炎性细胞浸润等现象;二甲双胍和马里苷组,心肌结构损伤有所改善,说明马里苷对心肌纤维化具有一定的保护作用(图1)。

图1 各组小鼠心肌组织HE染色结果Fig 1 HE staining results of myocardial tissue in each group

2.2 Masson染色观察小鼠心肌组织的纤维组织改变

在 db/db组心肌组织中,胶原纤维的含量较 db/m组显著增加(P<0.01);二甲双胍和马里苷组心肌组织胶原纤维表达明显减少(P<0.01)(图2)。

Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.图2 各组小鼠心肌组织Masson染色结果Fig 2 Masson staining of myocardial tissues of mice in each n=6)

2.3 免疫组织化学检测小鼠心肌组织vimentin的表达

与 db/m组相比, db/db组小鼠心肌细胞质内有更多的黄色区域;与db/db组相比较,二甲双胍和马里苷组心肌胞质中黄色区域减少(P<0.01)(图3)。

2.4 马里苷对心肌组织FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表达的影响

相对于db/m组,db/db组心肌组织FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表达明显增加(P<0.01),二甲双胍和马里苷组心肌组织FN1、vimentin和TGF-β1表达明显降低(P<0.01)(图4)。

FN.fibronectin; Met.metformin; *P<0.01 compared with db/m; #P<0.01 compared with db/db.图4 各组小鼠心肌组织FN1、vimentin和TGF-β1蛋白表达Fig 4 Expressions of FN1, vimentin and TGF-β1 protein in myocardial tissue of mice in each n=6)

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病发展到终末期的一种严重的并发症,是致糖尿病患者高病死率严重的并发症[9]。在晚期高血糖会引起心肌结构改变,心肌细胞坏死、心肌细胞间质或血管周围纤维化、心肌肥大等现象[10]。有大量证据表明,糖尿病心肌病晚期的主要病理变化之一就是糖尿病心肌纤维化[11],但其机制仍不清楚。

前期研究结果证明,马里苷可以使糖尿病小鼠血清胰岛素、总胆固醇、三酰甘油有所降低,也具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤等多种生物学效应,以及预防高糖改善胰岛素抵抗活性、抑制糖尿病肾病的纤维化的作用[12]。但马里苷对糖尿病性心肌病的纤维化的作用尚不清楚。

TGF-β1是组织损伤后诱导这些胶原蛋白质所需的细胞因子。大量实验表明,用TGF-β1刺激心肌成纤维细胞可转换为肌成纤维细胞,并且使细胞外基质(ECM)过度沉淀、Ⅰ型、Ⅲ型胶原过量合成,引起心肌纤维化。TGF-β1通过跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶激活Smads,连续调节靶基因的转录[13]。根据本实验研究可说明TGF-β1与糖尿病心肌纤维化具有密切联系,且马里苷对糖尿病心肌纤维化具有一定保护作用。

在糖尿病心肌病中,成纤维细胞可能产生具有纤维化特性的特殊基质蛋白如纤维黏连蛋白(FN),FN1为FN其中的一个亚型。FN1在高血糖的情况下是细胞外基质的积累成分,FN的聚合紧密调节不同ECM蛋白的组装,包括I型胶原蛋白[14]。Vimentin是一种常用的细胞标志物,它以很高的灵敏度标记成纤维细胞。为了表征成纤维细胞来源的细胞,通常使用vimentin[15]。FN1和vimentin蛋白在心肌中有较高的表达,当心肌发生纤维化时表达会明显上升。研究表明马里苷可以降低糖尿病db/db小鼠心肌组织FN1、vimentin、TGF-β1的表达,改善心肌结构的损伤以及心肌组织胶原纤维的沉积,马里苷对糖尿病db/db小鼠心肌纤维化具有保护作用,具有一定的应用价值,具体机制有待进一步研究。