提高m6A去甲基化酶FTO表达抑制鼻咽癌细胞增殖

廖镇城，杨思懿，吴平安*

1.香港大学深圳医院 耳鼻咽喉头颈外科，广东 深圳 518000；2.深圳大学 医学部，广东 深圳 518000

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部的恶性上皮性肿瘤,多见于东南亚,具有高度侵袭和转移的特性。中国发病地域差异大,主要分布于广东、福建、香港等地,在华南、东南亚等流行地区发病率高达30/10万[1]。表观遗传修饰是指基因功能发生可逆和可遗传的改变,而不改变基因组DNA序列,如DNA甲基化、RNA甲基化和组蛋白乙酰化等。研究表明,表观遗传调控在哺乳动物的胚胎发育、分化和疾病发生中发挥着重要作用。N6甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是 mRNA 序列中最普遍和最常出现的表观修饰之一,这是一个动态可逆的修饰过程[2]。该过程由 METTL3、METTL14 和 WTAP 组成的甲基转移酶复合物催化,也可被称为“解码器”的去甲基化酶 人类脂肪和肥胖相关(fat mass and obesity-associated,FTO)蛋白和 ALKBH5“擦除”[3]。随着高通量测序技术的快速发展和表观遗传学研究的深入,m6A甲基化在各种生物进程中的作用引起了广泛关注, m6A的研究逐渐成为生命科学领域最大的前沿研究热点之一。大量研究表明,m6A通过调控mRNA剪接、稳定性、翻译效率等调控基因表达,调控microRNA加工等途径,参与DNA损伤修复、干细胞分化、肿瘤发生等生物学过程[3]。

2011年首次发现FTO具有m6A去甲基化酶的活性[4],使m6A修饰成为类似于DNA甲基化和组蛋白乙酰化的动态可逆修饰过程。研究表明,FTO有助于癌干细胞的自我更新和免疫逃逸,也证明了FTO在靶向治疗方面的潜力[5]。 有研究[6]发现FTO在人乳腺癌中上调,与乳腺癌患者较低的生存率显着相关;在肾癌细胞中发现了 FTO 与肿瘤抑制因子VHL(Von Hippel-Lindau) 之间具有相互影响合成,致细胞死亡的作用[5]; 而m6A可提高胰腺癌细胞对化疗和放疗的抵抗能力[7]。另有研究表明m6A去甲基化酶FTO在癌的发生、发展中具有关键作用[8]。迄今关于m6A在鼻咽癌中的研究少之又少,尚未见有去甲基化酶FTO对鼻咽癌发生,发展中的作用的研究。本研究假设m6A去甲基化酶FTO在鼻咽癌的发生,发展中具有重要作用。本研究以期通过组织水平,蛋白水平,分子水平去验证假设,发现去甲基化酶FTO在鼻咽癌中的表达水平低于癌旁组织。基于此进行了生物功能实验,进一步探究FTO在鼻咽癌发生发展中的具体作用,希冀能找到鼻咽癌治疗的新方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 标本:鼻咽癌及癌旁组织标本(中国深圳 香港大学深圳医院),所有样本均采集自 2019年至2021年就诊的患者,共82例,男性 47 例,女性 25例。标本入组条件:患者临床诊断为鼻咽癌,且未接受过任何化疗或放疗。所有患者均知晓标本的去向和目的,并签署知情同意书。香港大学深圳医院医学研究伦理委员会批件号:伦[2019]101。

1.1.2 细胞系与小鼠:人鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2、5-8F来源于鼻咽癌(香港大学深圳医院中心实验室);人鼻咽癌细胞系C666-1和人永生化鼻咽癌细胞系NP69(上海科学院细胞库);OE(仅代表5-8F过表达株) 来源于鼻咽癌(香港大学深圳医院中心实验室);6周龄雄性裸鼠(中国深圳 拓扑生物科技)。

1.1.3 试剂盒:10%胎牛血清、 RPMI-1640和补充有牛垂体提取物的角质形成细胞/无血清培养基(Gibco公司);过表达慢病毒(中国上海吉凯基因医学科技股份有限公司);TRIzol试剂(Invitrogen公司);一抗FTO兔单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司);NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) 试剂盒(Novoprotein公司);QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen公司);ECL 试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养:所有细胞系均在于37 ℃恒温,含有5% CO2的培养箱中培养,达到对数增殖期时收集。

1.2.2 构建质粒和稳定转染:通过中国上海吉凯基因购买FTO过表达载体,该过表达载体将完整的人FTO(NM-001363894)基因置于GV492载体中,以无FTO序列的空载体作为对照。 将合成的人FTO基因连接到过表达载体GV492(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)上。重组慢病毒感染鼻咽癌细胞5-8F,用嘌呤霉素(2 μg/mL)筛选出稳定表达成功的细胞株5-8F 0E。 所有转染步骤均按照说明书进行。RT-qPCR和蛋白质免疫印迹分别验证转染后细胞中mRNA和FTO蛋白的表达水平。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞中mRNA水平:使用 TRIzol 试剂从细胞中提取总 RNA,在-80 ℃的无RNA酶水中储存。对于RT-qPCR,使用NovoScript Plus ALL-in-one1st Strand cDNA Synthesis Supermix (gDNA Purge) (oncoprotein)试剂盒将总RNA合成第1链cDNA。核糖体蛋白S18的mRNA含量作为内部参照。FTO的引物序列为:正链5′-ACTTG GCTCCTTATCTGACC-3′,反链 5′-TGGTGCAGTGT GAGAAAGGCTT-3′。使用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒进行扩增实验。 反应条件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s,55 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,共40个循环。 所有实验均运行3遍。 使用2-ΔΔCt方法计算FTO的相对表达水平。

1.2.4 免疫组织化学检测鼻咽癌组织及癌旁组织中FTO蛋白:用4%多聚甲醛固定组织,经过石蜡包埋,切片,切片机切成4 μm切片,将载玻片加热至72 ℃,加入150 μL Dond dewax solution,孵育30 min,用酒精冲洗1次并用 Bond wash solution 洗涤1次,加入150 μL BOND epitope retrieval solution2,在100 ℃ 下孵育20 min,然后再次使用150 μL Dond dewax solution冲洗载玻片。打蜡3 min。室温孵育 150 μL 1抗 FTO(1∶1 000 稀释度;Proteintech),用 150 μL Dond wash solution 洗涤 3 次,室温孵育150 μL一抗 8 min,150 μL Dond wash solution洗3次,每次2 min。加入15 mL辣根过氧化物酶,室温孵育8 min,用Dond wash solution洗3次,再用去离子水洗1次,加入150 μL peroxide,室温封闭5 min,用 Dond wash solution冲洗3次,再用去离子水洗1次。 预先准备好的 DAB Part1 和 DAB Part B,现场制备mixed DAB refine 150 mL,在室温下孵育6 min,然后用 Dond wash solution洗涤3次。加入150 μL苏木精,室温孵育8 min。最后,在用去离子水冲洗2次,添加 Bond wash溶液以恢复蓝色。后用乙醇脱水,脱蜡,并用中性胶固定在载玻片上。使用DAB显示免疫复合物。最后显微镜摄影。

1.2.5 Western blot检测细胞中的FTO蛋白:用 RIPA 裂解缓冲液从细胞系中提取蛋白质并测定目标分子的蛋白质水平。通过SDS-PAGE分离蛋白质,将蛋白质转移到PDVF膜上。在室温下用5% BSA封闭 1 h后,将膜与一抗孵育常温过夜。用TBST溶液洗涤膜3次,每次5 min,并与二抗在室温下孵育1 h。最终使用 ECL 试剂盒对蛋白质进行可视化摄影。

1.2.6 软琼脂集落增殖实验:将10 000个FTO转染细胞和阴性对照细胞接种在软琼脂平板上(下层琼脂1.0%,上层琼脂0.7%)。平板在 37 ℃ 培养箱中增殖9 d,每 3 d更换1次培养基。在琼脂上平铺1层培养基防止干燥[9]。显微镜下随机观察拍照,计数大于0.1 mm的细胞集落数。

1.2.7 体内成瘤及增殖实验:共10只6周龄雄性裸鼠分为两组。随机挑选5只小鼠,注射过表达FTO的鼻咽癌细胞5-8F OE,其余小鼠作为对照。所有动物实验程序均经香港大学深圳医院伦理委员会批准。首先,计数3×106个5-8F OE NPC细胞和5-8F NPC细胞, 4 ℃冷藏,将不同组的细胞按组分别注射到小鼠腋前脂肪垫皮下[10]。裸鼠常规喂养2周,观察肿瘤形成情况,每3～4 d测量肿瘤大小,直至最后1 d处死小鼠。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NPC组织和NPC细胞中FTO低表达

NPC组织中FTO蛋白水平降低(图1A～C)。鼻咽癌细胞中FTO蛋白和mRNA水平低于NP69(图1D,E)。这些结果均表明 FTO 在鼻咽癌细胞中低表达。

A.immunohistochemical picture of adjacent cancer tissue; B.immunohistochemical picture of nasopharyngeal carcinoma tissue; C.quantification of FTO tissue expression in immunohistochemistry; D.Western blot of each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69; E.relative expression of FTO mRNA in each nasopharyngeal carcinoma cell line and the human immortalized nasopharyngeal carcinoma cell line NP69;*P<0.05 compared with control group; MOD.mean oplical density.图1 免疫组化与蛋白质印迹显示FTO的表达情况Fig 1 Immunohistochemistry and Western blotting showed the expression of n=3)

2.2 过表达FTO 的5-8F抑制NPC细胞的增殖

成功构建1个过表达 FTO 的 5-8F 鼻咽癌细胞系OE,并通过qPCR进行验证(图2A)。软琼脂集落形成试验表明FTO过表达抑制鼻咽癌细胞的增殖(图2B,C)。

A. 5-8F was the control group, OE was the over-expression experimental group; QPCR showed that FTO was successfully over-expressed; B,C. soft agar proliferation experiment comparison chart and quantification chart;*P<0.05 compared with control group.图2 FTO过表达抑制鼻咽癌细胞的增殖Fig 2 Over-expression of FTO inhibits the proliferation of n=3)

2.3 FTO在体内抑制肿瘤细胞增殖

成功建立了小鼠模型,观察14 d,发现NPC细胞的成瘤性良好,过表达FTO的NPC细胞(OE组)增殖速度明显低于对照组 (5-8F)(图3A,B)。

A.in vivo tumor formation experiment in mice: comparison of the actual size of tumors taken from two groups of mice; B.comparative quantitative chart of tumor volume between two groups;*P<0.05 compared with control(5-8F) group.图3 小鼠体内成瘤实验表明过表达FTO降低了鼻咽癌细胞的增殖速度Fig 3 Tumorigenesis experiments in mice showed that over-expression of FTO reduced the proliferation rate of nasopharyngeal carcinoma cells in

3 讨论

鼻咽癌的病因独特而复杂,其发生发展的机制尚不完全清楚。目前公认的鼻咽癌高危因素包括EB病毒感染,高盐高渗的饮食习惯,遗传家族病史和某些人类白细胞抗原Ⅰ类基因型等[11]。当前m6A调节因子(阅读器、 书写器和擦除器)已成为研究热点,其作用体现在多种癌中,包括人类乳腺癌[6]、肾癌[4]、胰腺癌[7]等。作为m6A调节因子擦除器之一的去甲基化酶FTO受到越来越多的关注,并在各种癌均见报道。研究表明 FTO 水平在肝癌组织和细胞中上调,FTO的过表达与肝癌患者个体的不良预后相关[12];也有研究发现FTO通过对长链非编码RNA LINC00022的去甲基化促进了体内食管鳞状细胞癌的肿瘤生长[13];在膀胱癌的发生发展中,发现了FTO通过m6A RNA修饰方式调节MALAT/miR-384/MAL2轴促进[14]。研究表明FTO通过IGF2BP2介导的m6A修饰抑制载脂蛋白E的表达,并可能通过调节 IL-6/JAK2/STAT3信号通路抑制甲状腺乳头状癌中的糖酵解代谢,从而消除肿瘤生长[15]。前人对FTO的研究表明,FTO在癌的发生发展中起重要作用,既可以作为抑癌基因,也可作为癌基因发挥作用。然而,关于m6A调节因子在鼻咽癌中的表达方式和功能的报道非常少,关于去甲基化酶FTO与鼻咽癌发生发展关系的研究目前尚未见报道。本研究研究证明了 FTO在鼻咽癌细胞中低表达,这与组织标本的表达趋势是一致的,而过表达FTO可逆转对鼻咽癌增殖过程中的促进作用,这与报道在对于FTO在甲状腺乳突状癌中的功能表达是一致的[15]。而FTO在膀胱癌,食管鳞状上皮细胞癌的表达及功能却是相反的,这可能存在细胞来源,培养坏境,操作偏倚等过程中的误差。FTO在癌细胞中表达的高低和能否作为是调控癌细胞增殖的关键基因,还需要更多的生物学信息指导及明确其调空机制。本研究指出FTO在鼻咽癌细胞中低表达,并表明FTO具有抑制鼻咽癌的增殖能力,这一点在以往的研究中并未被发现。因此得出FTO在鼻咽癌中作为一个抑癌基因,在NPC进展过程中抑制鼻咽癌细胞的增殖,并表明 FTO可能是未来 NPC治疗的有希望的靶点。

在本研究中,验证了m6A甲基化酶中擦除器之一的 FTO在NPC低表达,促进了鼻咽癌细胞的增殖。过表达FTO逆转了这种作用,抑制了鼻咽癌细胞的增殖。因此本研究得出FTO在NPC中作为一个抑癌基因,在NPC进展过程中抑制鼻咽癌细胞的增殖,并表明FTO可能是未来NPC治疗的有希望的靶点。