基于Keap1 /Nrf2信号通路探讨中药干预肾纤维化研究进展

陈 曦,董凯旋,周 荣,于小勇

(1. 陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2. 陕西省中医医院,陕西 西安 710003)

慢性肾脏病(CKD)是慢性进行性且严重危害人类生命健康的常见病,据统计全球CKD患病率约为13.4%[1],根据横断面调查中国患者CKD患病率为10.8%[2],且有日益增高趋势。肾纤维化是进展至终末期肾脏病主要的病理过程,其发病机制错综复杂,临床治疗上大多用RAAS系统抑制剂以改善症状和延缓 CKD发展,治疗方案仍具有局限性。中药具有相对安全性高、多途径、多靶点的优势特点,单味中药及中药复方有效成分在防治肾纤维化方面具有独特优势,诸多的学者开始研究以Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/转录因子核因子E2相关因子2(Nrf2)作为治疗肾纤维化的药理靶点,Keap1/Nrf2通路在抗氧化应激防御系统起关键作用,可通过激活Keap1/Nrf2信号通路诱导抗氧化相关蛋白的表达以减轻氧化应激和炎症反应,进而延缓肾纤维化进程[3]。中药靶向调控相关信号通路在防治肾纤维化方面具有重要意义。本文通过阅读文献关于Keap1/Nrf2信号通路在肾纤维化中的调控作用机制及近年来中药通过靶向Keap1/Nrf2信号防治肾纤维化研究成果进行综述,以期为临床中医药防治肾纤维化提供更多循证依据。

1 Keap1/Nrf2信号通路概况

Keap1/Nrf2通路作为抗氧化应激信号通路,具有减轻炎症反应,提高机体组织防御氧化能力的作用[4]。Keap1是氧化应激反应传感器蛋白,作为负向调节因子抑制Nrf2转录活性。Keap1的5个结构域包括有N 末端区域、BTB蛋白结构域、IVR干预区域、双甘氨酸重复结构域(Kelch区)和C末端区域。BTB蛋白参与Keap1与Cul3在N末端区域结合与Keap1同二聚化,促进Nrf2泛素化和抑制其活性,使Nrf2稳定存在细胞质中[5]。IVR区域含有 Keap1 反应性的半胱氨酸残基,是Nrf2的负向调节器,含有相关序列核输出信号,在细胞质中具有定位作用[6]。Kelch区包含6个重复Kelch基序,是Keap1与Nrf2结合的区域[7]。Nrf2作为抗氧化应激反应的主要转录蛋白,其转录活性受Keap1控制,通过上调细胞抗氧化基因表达发挥减轻氧化应激作用。Nrf2的7个 Nrf2-ECH 同源结构域(Neh1-7)调节Nrf2转录活性[8]。Neh1结构域是Nrf2结合小腱膜纤维肉瘤蛋白(Maf)形成异源二聚体,与抗氧化物反应元件(ARE)结合使Nrf2二聚化产生活性。Neh2结构域含有DLG和ETGE序列,在Kelch区域与Keap1结合,调控Nrf2活性。Neh3是反式激活活性结构域,Neh4和Neh5结构域协同促进Nrf2与ARE结合控制下游相关基因转录。Neh5结构域调控Nrf2细胞定位,Neh6区域含大量丝氨酸,Nrf2在该区域降解,在Neh7结构域抑制 Nrf2表达[6,9]。

在正常功能状态下,Keap1与Nrf2处于细胞质中稳定结合,Keap1在BTB区与Cul3结合,与Nrf2在Kelch区结合,形成Keap1-Nrf2复合物,Keap1介导Nrf2泛素化,促进蛋白酶体降解Nrf2,Nrf2以低水平状态维持其抗氧化效能。氧化应激时,Keap1-Nrf2结构破坏,导致Keap1的BTB和IVR结构域上的半胱氨酸残基氧化,Keap1构像改变以及Keap1-Cul3复合物的分离,抑制Nrf2泛素化。Nrf2的DLR基序从Keap1的DGR结构域分离,Nrf2磷酸化上调细胞质中Nrf2水平,Nrf2与Keap1解离并转移到细胞核中,Nrf2与Maf结合并识别ARE,促进下游抗氧化基因的转录编译相关蛋白,以增强细胞组织抗氧化能力[10-11]。见图1。

图1 Keap1-Nrf2信号通路激活机制

2 Keap1 /Nrf2在肾纤维化中的作用

肾纤维化是以成纤维细胞增殖合成细胞外基质 (ECM) 积聚沉积形成瘢痕组织、破坏肾脏结构功能为特征。在病理条件下,肾小管上皮细胞转化为间质细胞表型和活化的成纤维细胞,发生上皮-间质转化(EMT),最后形成肾间质肌纤维母细胞[12],肾纤维化机制与氧化应激损伤、炎细胞浸润、EMT及ECM积聚有关。ECM的过度沉积及EMT共同加剧肾损伤的严重程度,加快CKD进展[13]。研究表明,氧化应激是肾脏疾病发病和进展的主要影响因素,在CKD的病理生理及相关并发症中起重要作用。氧化应激状态下活性氧(ROS)积聚过多导致氧化还原系统失衡,促进炎性因子浸润,加剧炎症反应及细胞损伤,诱导促纤维化细胞因子活化,使肾小球ECM沉积,进而引起系膜增厚,肾小球硬化及肾间质纤维化,加重肾脏损伤和肾功能减退,加速肾纤维化进展[14-15],因此调控氧化应激及炎症反应是管理CKD的重要举措。

在缺氧缺血等条件下,细胞线粒体功能失调,产生大量ROS堆积导致DNA损伤,肾脏启动氧化应激反应,刺激释放炎性因子,诱导促纤维化细胞因子和ECM蛋白的表达,ECM过度沉积,进一步肾纤维化。Keap1 /Nrf2 与炎症反应、细胞损伤、细胞凋亡等多种病理生理过程密切相关[16]。氧化应激促进激活Nrf2并上调表达,活化的Nrf2抑制炎性因子表达,ROS产生减少,可显著减轻肾损伤,改善肾脏功能。研究表明,模型大鼠中使用Nrf2激活剂,Nrf2的抗氧化作用能明显改善肾小管损伤,延缓CKD进程[17],缺血再灌注损伤模型及UUO小鼠模型中小鼠的Nrf2表达明显上调,有效降低模型小鼠氧化应激损伤和炎症反应程度,具有保护肾脏的功能[18]。孙德胤等[19]研究发现,通过激活Keap1/Nrf2信号通路作用于NS模型大鼠可抑制炎症反应,减少生成氧化应激产物,发挥抗肾纤维化作用。Adelusi等[3]研究发现,糖尿病肾病晚期代谢终产物可能会引发氧化应激,通过激活Keap1/Nrf2,下调Keap1,促使Nrf2移位至细胞核,抑制ROS过度产生,下调纤维连接蛋白和转化生长因子β1蛋白表达,明显减缓糖尿病肾病的发展,研究结果揭示Keap1下调在改善肾纤维化中发挥一定的作用。Aminzadeh等[20]研究发现,Nrf2缺陷会导致老年雌性小鼠发生狼疮肾炎,缺乏Nrf2基因小鼠也因易感染链脲佐菌素而诱发糖尿病肾病,这表明通过调控Nrf2基因水平可以防治肾脏病相关并发症。CKD模型大鼠出现肾小球硬化、炎症和肾纤维化与Nrf2及靶基因表达下调相关,Nrf2的抗氧化功效作用被证实对糖尿病肾病、CKD、肾纤维化的病理变化产生重要的影响[21]。虽然Keap1/Nrf2信号与肾纤维化的发病机制尚未直接关联,但通过现有研究发现,激活Keap1/Nrf2信号传导和减少ROS过量产生来改善和缓解氧化应激损伤是保护肾功能和防治肾纤维化的有效策略[22]。

综上所述,Keap1/Nrf2是通过Nrf2与Keap1解离,促进Nrf2移位入核和Nrf2磷酸化发出信号,可以减轻氧化应激引起的肾脏相关疾病。激活Keap1/Nrf2信号通路可转录表达抗氧化酶基因,清除ROS,延缓肾纤维化进展[23]。因此调控Keap1/Nrf2信号通路发挥抗肾纤维化作用是重要的研究方向。

3 中医药干预Keap1/Nrf2信号治疗肾纤维化

现代医学研究表明,治疗肾脏疾病的中药具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡及防治肾纤维化作用,对于改善肾脏结构功能、延缓肾纤维化进程等方面有重要研究意义。肾纤维化病机总结为本虚标实,以脾肾亏虚为本,血瘀、浊毒为标[24],在中医辨证论治理论指导下应以扶正祛邪、健脾益肾、活血通络、通腑泄浊为治法[25]。中医药研究单味中药、中药提取物及中药复方中有效成分可调控Keap1/Nrf2信号通路治疗肾纤维化,有效提高机体抗氧化防御能力,抑制炎症反应和延缓肾脏纤维化,减轻尿蛋白等临床症状。因此,基于近年来学者们研究单味中药及中药复方通过干预Keap1/Nrf2信号通路治疗肾纤维化作用机制进行总结归类。

3.1单味中药及其提取物

3.1.1补虚 补虚类药物具有扶正祛邪作用,可增强免疫力、抗氧化、抗应激,促进核酸代谢及蛋白合成[26]。黄芪功效为补气升阳、排毒生肌,其有效成分黄芪甲苷具有抗炎、抑制纤维化的作用[27],可抑制氧化反应、提高抗氧化能力,相应地减少ROS堆积。徐进等[28]研究总结黄芪甲苷具有抗炎性蛋白、清除氧自由基的作用,通过下调纤维化因子表达,逆转EMT进而延缓肾纤维化进展。还有研究显示,黄芪多糖通过激活Nrf2-Keap1信号通路发挥抗炎反应效能[29]。这表明黄芪有效成分可通过激活Keap1/Nrf2防治肾纤维。当归功效为补血活血,黄芪和当归药对能够改善DM小鼠肾脏损伤,减少蛋白尿、改善肾功能、抑制高血糖相关氧化应激反应,提高抗氧化能力,作用机制可能与激活Nrf2/HO-1通路关联[30]。淫羊藿功效为补肾助阳,牟俊杰等[31]对肾缺血再灌注大鼠模型分别以25,50,100 mg/kg灌胃淫羊藿苷7 d,结果发现淫羊藿苷可有效减轻模型大鼠肾缺血和氧化应激状态,改善肾功能,量效关系成正比,与上调Nrf2水平,介导Nrf2/HO-1信号通路相关。人参功效为补脾益肾、生津养血。Guo等[32]通过动物研究发现,人参酚通过激活 Keap1/Nrf2传导抑制氧化应激,发挥抗纤维化作用。杜仲功效为补益肝肾,现代药理研究发现杜仲具有强抗氧化活性、降血糖等功效,许碧琪等[33]分别以80,160 mg/(kg·d)杜仲黄酮给糖尿病肾病模型小鼠灌胃给药共60 d,结果发现杜仲黄铜可降低模型小鼠血糖和改善肾功能,通过调节Nrf2信号通路,抑制肾脏组织氧化应激状态,降低肾脏组织氧化损伤程度,保护肾脏结构功能。山药补脾益肾,研究显示,山药可通过上调Nrf2、HO-l蛋白的表达,提高组织抗氧化功能减少大鼠病理损伤[34]。

3.1.2活血化瘀 活血祛瘀类中药具有提高细胞组织代谢,改善毛细血管通透性,减轻炎症反应等作用[35]。丹参活血祛瘀、凉血消痈。吴平亚等[36]用5,10,20 mg/(kg·d)丹参素给糖尿病肾病小鼠灌胃42 d,结果表明丹参素可抑制MEK、ERK蛋白磷酸化,上调Nrf2蛋白表达,改善DN模型大鼠肾功能及肾脏纤维化。川芎功效为活血行气。研究发现川芎提取物可促进Nrf2表达, 激活下游抗氧化相关基因的表达,从而减轻氧化应激对肾脏的损伤[37]。姜黄功效为破血行气、通络止痛。研究发现姜黄素可上调Nrf2转录因子以减缓炎症和氧化应激反应,从而改善肾小球ECM过度沉积,减轻肾脏损伤[38],还可启动Nrf2/HO-1发挥抗氧化效能,改善足细胞损伤[39],可见姜黄可通过调控Nrf2信号通路发挥抗肾纤维作用。三七功效为祛瘀消肿。董苏敏等[40]通过药理研究发现,三七总皂苷能有效改善糖尿病小鼠肾脏病理损伤,与激活Nrf2/HO-1信号传导减轻氧化应激及炎症反应有关。红景天具有益气活血功效。红景天苷是红景天中提取的有效成分,可减轻肾脏细胞损伤,延缓糖尿病肾病肾纤维化进展[41]。研究发现红景天苷通过上调Nrf2的表达,减少高级糖基终产物引起的细胞凋亡并改善肾脏组织损伤,这说明红景天有效成分能抑制肾纤维化,与其激活体内Nrf2信号以减轻炎症和抑制细胞凋亡相关[42]。

3.1.3通腑泄浊 肾络受损使得水液代谢失调,津液不化,气血运行不畅,久聚生成瘀毒,浊毒久郁体内损伤肾脏,因此中医以通腑泄浊为法治疗肾纤维化。大黄具有泻下攻积、凉血解毒功效。贾合磊等[43]研究发现大黄提取物能改善肾损伤模型大鼠肾脏结构功能,且肾损伤大鼠的细胞凋亡率下降,Keap1、HO-1与Nrf2和p-Nrf2蛋白水平比值显著升高,这表明大黄提取物可介导Keap1/Nrf2通路抑制释放炎性因子和肾组织细胞凋亡,发挥抗肾纤维化作用。茯苓功效为利水、渗湿、健脾。陈丹倩[44]研究发现茯苓的有效成茯苓酸可通过调控Keap1/Nrf2信号通路减轻氧化应激与炎症反应,抑制成纤维化因子活化,减少EMT积聚和ECM沉积,抑制肾纤维形成。虎杖功效为清热利湿解毒。虎杖苷是虎杖的主要成分,又称白藜芦醇苷,药理研究表明其具有抗炎、抗氧化等多药理作用,白藜芦醇苷可通过激活Keap1-Nrf2信号通路抑制肾纤维化,减缓CKD进展[45]。黄连功效为清热燥湿、泻火解毒。刘月等[46]研究发现,黄连激活Nrf2/HO-1信号通路可减轻糖耐量异常模型大鼠肾损伤,黄连素具有改善小鼠糖尿病肾病肾脏损害作用,可能与调控Keap1-Nrf2信号通路改善氧化应激相关[47]。黄连主要成分小檗碱是一种天然化合物,通过上调 Nrf2表达抑制氧化反应及发挥抗炎作用[48]。这些研究均表明黄连可通过调控Keap1-Nrf2信号通路防治肾纤维化。

3.2中药复方 肾纤维化病机虚实夹杂,错综复杂,中药复方基于“辨证论治”“整体观念”的中医理论特点指导,现研究发现中药通过多组分、多靶点协同调控Keap1/Nrf2信号通路改善肾纤维化,获得良好的临床疗效。虫草益肾方由冬虫夏草菌丝粉、黄芪、熟大黄、水蛭等组成,具有清化浊毒之效。罗珊[49]研究发现,虫草益肾方能抑制Keap1蛋白表达,上调Nrf2表达,促进Nrf2抗氧化信号通路激活,保护输尿管梗阻大鼠肾脏功能,发挥抗肾间质纤维化作用。益气化湿通络方由黄芪、当归、川芎、红花、地龙、水蛭、仙茅等中药组成,具有益气、化湿、通络功效,通过调控Keap1/Nrf2信号通路维持炎症与抗氧化反应平衡,影响促纤维化蛋白表达,抑制肾切除大鼠肾纤维化[50]。金匮肾气丸具有温补肾阳、行气化水功效,通过激活Keap1/Nrf2信号通路,抑制Keap1蛋白表达,增加Nrf2表达,改善慢性肾衰竭大鼠受损的肾脏功能[51]。芪精益肾汤由黄芪、黄精、川芎、人参叶四味药组成,具有益气活血功效。陶春鹤等[52]研究发现,芪精益肾汤通过促进Nrf2/HO-1信号传导,提高DN大鼠肾组织抗氧化应激能力,减轻肾脏组织损伤,下调FN的表达,这表明芪精益肾汤可以抑制ECM沉积,改善肾脏结构功能,能有效延缓肾纤维化进展。综上所述,体现了中药复方具有多靶点多效应调控的特点,因此研究以Keap1/Nrf2信号通路为切入点作为临床中药及中药复方改善肾脏纤维化新的方向,值得进一步深入探讨。

4 小 结

肾纤维化是一个多机制、多因素参与的动态的过程,其形成发展与多种细胞因子和信号通路异常表达调控相关,氧化应激是CKD进展的各个阶段的共同特征,因此,干预相关信号通路控制氧化应激以延缓肾纤维化进程是重要的研究方向。随着中医药不断发展以及中药在临床上治疗肾纤维化广泛应用,诸多研究人员们从细胞分子微观角度研究了中药单体及中药复方干预肾纤维化信号通路的作用机制。Keap1/Nrf2信号通路作为抗氧化应激的经典信号通路之一,研究已被证实通过调节Keap1/Nrf2信号通路,Nrf2可作为治疗肾纤维化的药物靶点,通过抑制Keap1表达,上调Nrf2转录因子表达,调控Keap1/Nrf2信号通路发挥抗氧化应激作用,为临床防治肾纤维化提供新途径。中药具有多成分、多途径、多靶点、多系统且毒副作用小等优点,中医角度认为肾纤维化是病邪入侵肾络,久积肾络瘀阻,继而形成微型癥积, 与西医损伤因子致成纤维细胞增生,微循环持续受损,进而形成肾纤维化的过程极为相似[53]。上述研究的单味中药及中药复方具有扶正祛邪、活血通络、通腑泄浊等功效,通过激活Keap1/Nrf2信号通路可减少ECM沉积、下调成纤维因子表达,保护肾功能,延缓减轻肾纤维化进展。因此,基于Keap1/Nrf2信号通路靶向中药防治肾纤维化有望成为新的治疗策略,中药在防治肾纤维化方面发挥独特优势,能有效延缓CKD进展,且在治疗上取得了良好的临床疗效,具有广阔的研究前景。但目前研究单味中药及中药复方通过调控Keap1/Nrf2通路发挥抗氧化抑制纤维化的临床及动物研究均较少,现有研究是关于通过干预Keap1/Nrf2信号通路与治疗肾纤维化的相关研究,还尚未有直接明确中医药调控Keap1/Nrf2信号抗肾纤维化的研究报道,日后仍需要更加深入系统的研究。不论是动物研究还是临床研究,对Keap1/Nrf2信号通路大多研究调控Nrf2靶点发挥效能,但对上游及下游基因靶点作用仍缺乏大量的相关研究。Keap1/Nrf2信号通路是否与其他信号靶点串扰协同发挥抗纤维化作用未来也需进一步挖掘探究。未来对Keap1-Nrf2信号通路不断深入探索,将会全方位、多角度认识Keap1 /Nrf2信号通路调控氧化应激及炎症反应发挥抗肾纤维化作用,为开发新的药物防治肾纤维化提供新的策略,以期为更好地防治肾纤维化提供参考依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。