夹脊穴埋线对大鼠脊髓损伤后自噬及BDNF/TrkB通路的调控作用

王 镌,李 玥,蒋 伟

(新疆医科大学第六附属医院,新疆 乌鲁木齐 830000)

脊髓损伤是一种由外伤、高处坠落等原因导致的中枢神经系统严重创伤,致残率极高,严重影响患者生活质量。脊髓损伤原发创伤常导致被膜破坏,神经纤维断裂,组织挫裂或出血性坏死,造成缺血、缺氧和炎症环境,继而持续损伤局部残存神经元,引起运动与感觉功能丧失[1]。脊髓神经元再生困难,损伤后难以恢复,因此促进残余神经元生长存活,防止其继发性死亡为脊髓损伤后神经功能修复的关键[2]。以甲基泼尼松龙为主的糖皮质激素为目前临床治疗继发性脊髓损伤的一线药物,但存在不良反应明显、并发症较多等问题,可能增加脊髓损伤后感染、糖尿病、肺栓塞等发生风险,在近年引起了许多质疑[3]。穴位埋线作为一种不良反应较小的传统外治法,通过将羊肠线埋入腧穴发挥长效刺激作用,在脊髓损伤的恢复治疗中受到广泛关注[4]。夹脊穴位于督脉与足太阳经之间,可通过督脉之别络调理二经经气,针刺该穴可改善脊髓损伤后神经和运动功能[5]。有研究表明,脊髓神经元自噬水平与脊髓损伤后继发性损伤程度关系密切,脑源性神经营养因子(BDNF)/原肌球蛋白受体激酶B(TrkB)信号通路的激活在其中发挥重要调控作用[6]。本实验通过复制脊髓损伤大鼠模型,探讨了夹脊穴埋线是否可通过BDNF/TrkB信号通路调节脊髓损伤自噬对神经损伤发挥修复作用。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠60只,体重180～220 g,由新疆医科大学提供,动物合格证号:SCXK(新)2023-0002。饲养于新疆医科大学医学实验动物中心,保持室温20～22 ℃,湿度50%～60%,自由进食饮水,于12 h光照与黑暗循环的SPF级动物房中适应性饲养1周。

1.2实验试剂与仪器 医用羊肠线,上海浦东金环医疗用品有限公司;无菌埋线针,镇江高冠医疗器械有限公司;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)大鼠ELISA试剂盒,深圳达科为生物技术有限公司;BDNF抗体试剂盒、DAB显色剂,武汉博士德公司;RIPA裂解液,上海碧云天生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒,Sigama公司;Beclin-1、LC3-B、BDNF、TrkB、p-TrkB鼠单克隆抗体及兔GAPDH多克隆抗体,CST公司;RNA提取、反转录试剂盒,TaKaRa公司;RT-PCR引物,上海生工生物工程股份有限公司提供。RM 2235切片机、DFC365FX相机,德国Leica公司;Mirofuge 20 R低温高速离心机,美国Thermo Fisher公司;Tekx 808多功能酶标仪、Mini-protean电泳仪,美国Bio-Rad公司;9700 PCR扩增仪,美国ABI公司。

1.3实验方法 将60只大鼠随机分为假手术组、模型组和穴位埋线组,每组10只。模型组和穴位埋线组大鼠采用改良式Allen’s重物坠落法[7]建立脊髓损伤模型:腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠后,将其俯卧固定于手术台中心,以T8椎板和棘突为中心做背侧切口,钝性分离背部筋膜组织,常规消毒后显露T7～T9椎板棘突,咬除T8段棘突椎板,显露相应硬脊膜为损伤区,于损伤区上方放置Allen’s WD装置,将5 g冲击棒由10 cm高度自由落下,定量打击脊髓致脊髓损伤,打击后硬脊膜见充血水肿,大鼠双下肢回缩、尾部痉挛性摆动,Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分1～3分提示脊髓损伤模型成功;假手术组仅切除T8段椎板,不损伤脊髓硬膜。各组大鼠手术完成后消毒伤口,逐层缝合,无法自主排尿的大鼠给予膀胱按压(2次/d)以恢复排尿,造模不成功者随机补充大鼠,并重新造模。造模完成后,穴位埋线组给予夹脊穴简易埋线:大鼠俯卧位固定,参照《实验针灸学》[8]定位损伤区上下两端的2段椎体旁夹脊穴,将0.5 cm长的羊肠线预先置入7号无菌埋线针头,推注入上述双侧夹脊穴,将羊肠线完全埋入腧穴内后退出针管,无菌药棉按压1 min,每7 d埋线1次;假手术组、模型组大鼠正常饲养,不予处理。

1.4检测指标及方法

1.4.1下肢运动功能 在实验第7天、第28天,采用BBB评分评价大鼠综合运动功能:将大鼠分别放置于观察盘中,观察大鼠下肢关节协调运动情况,分值范围为0～21分,运动功能正常为21分,下肢全瘫为0分,由2名观察员评分以减少主观影响。

1.4.2平衡能力 在实验第7天、第28天,采用斜坡实验评价大鼠身体平衡功能:将大鼠置于40°光滑斜面,适应1 min后逐渐升高斜面角度,记录大鼠保持其自身平衡5 s以上时的最大角度,即为斜坡实验角度。

1.4.3血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 分别于实验第7天、第28天经大鼠腹主动脉采血,离心取上清,按ELISA操作步骤检测:稀释标准品及血清样品,加入40 μL标准品、100 μL HRP标记的二抗和10 μL待测样品,于37 ℃温育60 min,洗涤剂洗涤后拍干孔板,每孔加显色剂A、B各50 μL,37 ℃避光显色10 min,于终止液终止反应10 min内检测450 nm波长下吸光度值,制作标准曲线,计算血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.4.4脊髓组织BDNF阳性表达情况 采用免疫组织化学染色法检测:取部分损伤区组织(假手术组取相同部位脊髓组织)放入4%多聚甲醛中固定24 h,放入包埋盒中依次进行脱水、透明、浸蜡包埋和切片,组织切片室温脱蜡、水化,加入0.3%的H2O2灭活内源酶活性,蒸馏水水洗后进行热抗原修复,加入5%BSA封闭液20 min,滴加预先稀释的一抗盖住组织,4 ℃孵育过夜,滴加二抗和SABC分别37 ℃温育20 min,滴加100 μL DAB溶液,显微镜下显色3～10 min后终止,再经苏木素复染、1%盐酸酒精分化、脱水、透明后中性树胶封片,于光学正置显微镜下观察,随机选取5个不重叠视野计数BDNF阳性染色细胞数。

1.4.5脊髓组织自噬蛋白及BDNF/TrkB通路蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取部分损伤区组织(假手术组取相同部位脊髓组织),充分匀浆后加入RIPA裂解液提取组织蛋白,BCA法检测蛋白浓度,100 ℃加热5 min使蛋白变性,根据分子量大小制备凝胶,取30 μg蛋白样品上样,采用SDS-PAGE转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭2 h,滴加一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,滴加二抗室温孵育2 h,TBST洗膜后加入ECL发光液,反应1 min后曝光成像,Image J软件分析蛋白条带灰度值,分别计算Beclin-1、LC3-B、BDNF与GAPDH的比值及p-TrkB与TrkB的比值。

1.4.6脊髓组织BDNF/TrkB通路因子mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测:取部分损伤区组织(假手术组取相同部位脊髓组织),充分研磨后,采用Trizol一步法提取总RNA,紫外分光光度仪测定RNA浓度,取2 μg组织反转录合成为cDNA,按PCR试剂盒进行PCR 扩增,BDNF上游引物:5’-GGGGTTAGGAGAAGTCAAGC-3’,下游引物:5’-GGACAGCCACTTTGTTTCA-3’;p-TrkB上游引物:5’-GGTTGAGTGACCTTGGTGA-3’,下游引物:5’-AAGTGGACCTATGACCCCTCTA-3’。反应程序:95 ℃ 10 min预变性,变性、退火、延伸各为95 ℃ 1 min,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,重复40个循环,2-△△CT法分析BDNF、p-TrkB的相对表达量。

2 结 果

2.1各组BBB评分、斜坡实验角度比较 实验第7天、第28天,模型组大鼠BBB评分及斜坡实验角度均明显低于同期假手术组(P均<0.05),穴位埋线组大鼠BBB评分及斜坡实验角度均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 假手术组和脊髓损伤各组大鼠BBB评分、斜坡实验角度比较

2.2各组血清炎症细胞因子水平比较 实验第7天、第28天,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显高于同期假手术组(P均<0.05),穴位埋线组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显低于同期模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 假手术组和脊髓损伤各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

2.3各组脊髓组织中BDNF阳性表达情况比较BDNF阳性表达分布于细胞质,呈棕黄或棕褐色。假手术组脊髓组织见少量BDNF阳性染色;模型组见较多BDNF阳性染色,阳性细胞数明显多于假手术组(P<0.05);穴位埋线组BDNF阳性细胞数较模型组进一步增多(P<0.05)。见图1及图2。

图1 假手术组和脊髓损伤各组大鼠脊髓组织中BDNF阳性表达情况(免疫组织化学染色,×400)

图2 假手术组和脊髓损伤各组大鼠脊髓组织中BDNF阳性细胞数

2.4各组脊髓组织中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白表达情况比较 实验第7天、第28天,模型组大鼠脊髓组织中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白相对表达量均明显高于同期假手术组(P均<0.05),且穴位埋线组大鼠脊髓组织中Beclin-1、LC3-B、BDNF、p-TrkB蛋白相对表达量均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见图3及图4。

图3 假手术组和脊髓损伤各组大鼠脊髓组织中Beclin-1、LC3-B蛋白表达情况

图4 假手术组和脊髓损伤各组大鼠脊髓组织中BDNF、p-TrkB蛋白表达情况

2.5各组脊髓组织中BDNF、TrkB mRNA表达情况比较 实验第7天、第28天,模型组大鼠脊髓组织中BDNF、p-TrkB mRNA相对表达量均明显高于同期假手术组(P均<0.05),且穴位埋线组大鼠脊髓组织中BDNF、p-TrkB mRNA相对表达量均明显高于同期模型组(P均<0.05)。见图5。

图5 假手术组和脊髓损伤各组大鼠脊髓组织中BDNF、p-TrkB mRNA表达情况

3 讨 论

穴位埋线以羊肠线机械性刺激体表穴位,可通过对腧穴的持续刺激和异物蛋白的液化、吸收过程激发经络之气,调节脏腑生理功能,调动机体内在的应激和抗病免疫功能,同时发挥抗炎、促进微循环等一系列功效,对于继发性脊髓损伤的防治具有其独特优势[9-10]。中医学将脊髓损伤归属于“截瘫”“痿病”范畴,认为本病病因为督脉受损,瘀血留滞太阳,致三阳经经气不通,气血阻滞,肢体筋脉失于濡养,而见麻木、懈惰不用等征象,治疗多以疏通督脉和足太阳经气血为主[11]。督脉解剖位置与脊髓重叠,其别络“别走太阳”,使两经脉气相通,华佗夹脊穴挟脊行于此两经之间,可通过督脉之别络调理二经经气,振奋一身阳气。从现代解剖学分析,夹脊穴附近有脊神经后支通行,交感神经纤维通过交通支与脊神经联系,针灸夹脊可促进脊神经功能恢复,调节交感神经活性,维持脊柱内环境稳态[12]。

本实验采用Allen’s 改良式重物坠落法建立脊髓损伤模型,结果显示大鼠造模后均出现后肢瘫痪表现,穴位埋线组大鼠埋线第7天、第28天的BBB评分及斜坡实验角度均明显升高,大鼠后肢逐渐有力,提示夹脊穴埋线可促进脊髓损伤后大鼠后肢运动能力的恢复。

脊髓损伤后损伤区微环境的改变可引起免疫炎症反应,通过释放过量炎症细胞因子进一步加重组织损伤[13]。研究发现,脊髓损伤早期即可见TNF-α、IL-6水平明显升高,TNF-α可促进IL-6及IL-1β自身的分泌,放大炎症反应,损伤脊髓神经元[14-15]。本实验中,大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平在脊髓损伤后急剧升高,给予夹脊穴埋线后,随着干预时间的推移,上述炎性细胞因子水平均明显降低,表明夹脊穴埋线具有明显的抑炎效果。

自噬为细胞在应激条件下为实现自身的代谢与更新需要,通过自我吞噬的方式降解过多蛋白,清除受损细胞器的过程[16]。在脊髓损伤病理进程中,缺血、缺氧环境可激活神经细胞自噬,对损伤局部起到保护作用[17]。BDNF是在脊髓生理、病理状态下发挥神经元保护作用的重要信号分子,脊髓损伤后脊髓前角细胞中BDNF的表达短暂减少,随后逐渐增多,促使其受体TrkB磷酸化,触发下游自噬相关通路以促进神经元自噬和存活[18-19]。本实验中,模型组脊髓组织中BDNF阳性细胞数和Beclin-1、LC3-B 、BDNF、p-TrkB蛋白相对表达量及BDNF、p-TrkB mRNA相对表达量均明显增加,提示脊髓损伤早期细胞自噬应激性激活,为损伤区的修复建立了良好微环境;经夹脊穴埋线干预后,脊髓组织中BDNF阳性细胞数和Beclin-1、LC3-B 、BDNF、p-TrkB蛋白相对表达量及BDNF、p-TrkB mRNA相对表达量进一步增加,表明夹脊穴埋线可通过激发神经元自噬活动促进脊髓损伤恢复。此外,自噬与炎症关系十分密切,通过诱导自噬体形成,促进细胞自噬可下调促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达,调节脊髓损伤炎症过程[20-21]。本实验表明夹脊穴埋线能增强脊髓损伤区自噬并抑制机体炎症反应,而其是否通过促进自噬来发挥抑炎作用尚需进一步研究。

综上所述,夹脊穴埋线可作为外源性刺激上调脊髓损伤区BDNF活性和TrkB磷酸化水平,可促进细胞自噬活动、减轻炎症反应以修复脊髓损伤后运动和神经功能损伤。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。