1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊对斑秃小鼠IFN-γ信号及NKG2D+CD8+ T细胞比例的影响

苏家光,黄家灿,罗世斌,陈信津,郑文军

(广西医科大学第一附属医院,广西 南宁 530021)

斑秃是一种自身免疫疾病,其特征是慢性反复斑块性脱发,平均2.1%的人群受到斑秃的影响[1]。在病程不足1年的轻微斑秃患者中,34%～50%的患者会自行消退,14%～25%的患者最终头皮的毛发全部脱落[2]。目前的研究证实,约1/4的斑秃患者有家族病史,提示有遗传易感性[3]。尽管斑秃被认为是良性疾病,但会使患者产生心理问题,影响其整体生活质量[4]。目前斑秃的主要治疗方法为皮质类固醇局部外用或病灶内注射,但受限于治疗效果欠佳和潜在的不良反应[3]。近年研究发现,1 565 nm非剥脱点阵激光治疗斑秃显示出较好疗效[5],侧柏叶酊也可有效改善斑秃[6],但二者治疗斑秃的机制并不清楚。斑秃的发病机制复杂,存在干扰素-γ(IFN-γ)特异性Th1细胞因子特征,IFN-γ的高表达可能通过上调毛囊中组织相容性复合体I的表达而导致毛囊免疫机制发生崩溃[7-8],而自然杀伤细胞(NK)型NKG2D+CD8+T细胞是浸润毛囊的主要免疫效应因子[9]。因此,本研究观察了1 565 nm非剥脱点阵激光和侧柏叶酊单独及联合应用对斑秃小鼠皮损毛囊组织中IFN-γ信号和血液中NKG2D+CD8+T细胞的调控作用,以为临床治疗斑秃提供有效方案及理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 10周龄雄性C3H/HeJ小鼠50只,体重(21.78±2.92)g,由广西医科大学实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(桂)2020-0003。在22 ℃昼夜交替的环境中,将小鼠饲养于标准的Micro-Isolator鼠笼中,每笼5只,自由摄入标准食物和自来水。本实验得到广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准(202105009)。

1.2主要药物、试剂与仪器 侧柏叶酊(侧柏叶15 g粉碎成粗粉,置密闭玻璃容器加70%乙醇300 mL 浸泡1周后,获取上清液即为侧柏叶酊);环磷酰胺,美国Selleck公司。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(#97166)一抗,美国Cell Signaling Technology公司;HRP偶联的亲和山羊抗小鼠IgG(H+L),美国Protein Tech Group公司;PVDF膜,美国MedChemExpress公司。IFN-γ一抗(554699),美国BD公司;IFN-γ受体1(IFNGR1)一抗(ab154400)和IFN-γ受体2(IFNGR2)一抗(ab171081),英国Abcam公司;CD8抗体(ab217344)和自然杀伤细胞活化受体2D(NKG2D)抗体(ab203353),英国Abcam公司。

1.3实验方法 将小鼠随机分为正常组、模型组、点阵激光组、侧柏叶酊组及点阵激光联合侧柏叶酊组,每组10只。除正常组外,其余组小鼠均采用环磷酰胺诱导斑秃:采用融化的松香和石蜡涂背脱毛,每天给予150 mg/kg环磷酰胺腹腔注射1次,连续6 d。在造模期间,点阵激光组给予1 565 nm非剥脱点阵激光治疗,1次/2 d;侧柏叶酊组取适量5%侧柏叶酊在脱毛部位轻微按摩2～3 min,1次/d;点阵激光联合侧柏叶酊组给予1 565 nm非剥脱点阵激光及5%侧柏叶酊外用治疗,方法同点阵激光组和侧柏叶酊组。

1.4检测指标及方法

1.4.1皮肤和毛发情况 观察各组小鼠皮肤状态和毛发生长情况。

1.4.2NKG2D+CD8+T细胞比例 实验第7天麻醉小鼠后,取外周血,分离单个核细胞,加入CD8-PE、NKG2D-APC抗体进行染色后,收集细胞,并用PBS洗涤1次,然后加入MICA/B-PE或Fas-FITC抗体染色(美国BD公司),冰上孵育30 min,上FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)进行检测,使用FlowJo软件进行数据分析。

1.4.3毛囊组织中IFN-γ及其受体IFNGR1和IFNGR2表达情况 采用Western blot 法检测:取脱毛部位毛囊组织,根据蛋白裂解液说明书,用RIPA缓冲液匀浆,提取总蛋白。蛋白样品用7.5% SDS-PAGE凝胶(30 μg蛋白质/10 μL每孔)在电泳仪上进行电泳分离,分离蛋白电转移到PVDF膜上。分别加入IFN-γ一抗(1∶600)、IFNGR1一抗(1∶800)、IFNGR2一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜,PBS清洗后,用HRP山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h。PBST清洗后用增强的化学发光试剂显色,以GAPDH为内参,使用Image J软件计算蛋白表达条带灰度值。

2 结 果

2.1各组小鼠皮肤和毛发情况 正常组小鼠毛发生长分布均正常,体毛浓密;各造模组小鼠均出现了脱毛和皮肤裸露的特征,其中模型组小鼠斑秃部位的毛发出现断裂、变细,裸露皮肤表面出现黑点;各干预组斑秃情况均较模型组轻,其中点阵激光联合侧柏叶酊组最轻。见图1及图2。

图1 正常组和斑秃各组小鼠肉眼观察皮肤和毛发情况

2.2各组小鼠血液中NKG2D+CD8+T细胞比例比较 正常组NKG2D+CD8+T细胞比例为(0.67±0.05)%,模型组为(11.32±2.05)%,模型组明显高于正常组(P<0.05);点阵激光组、侧柏叶酊组、点阵激光联合侧柏叶酊组血液中NKG2D+CD8+T细胞比例分别为(11.03±1.38)%、(11.10±2.07)%、(1.64±0.21)%,点阵激光联合侧柏叶酊组血液中NKG2D+CD8+T细胞比例明显低于模型组及点阵激光组、侧柏叶酊组(P均<0.05),点阵激光组、侧柏叶酊组与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3。

图3 正常组和斑秃各组小鼠血液单个核细胞中NKG2D+CD8+ T细胞的比例

2.3各组小鼠毛囊组织中IFN-γ及其受体IFNGR1和IFNGR2表达情况 模型组毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);点阵激光组、侧柏叶酊组毛囊组织中IFN-γ 蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);点阵激光联合侧柏叶酊组毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量均明显低于模型组及点阵激光组、侧柏叶酊组(P均<0.05)。见图4和表1。

表1 正常组和斑秃各组小鼠毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白相对表达量比较

图4 正常组和斑秃各组小鼠毛囊组织中IFN-γ、IFNGR1、IFNGR2蛋白表达电泳条带

3 讨 论

NKG2D+CD8+T细胞比例增加是斑秃疾病的一个重要特征。相关研究表明,在斑秃慢性期,淋巴和皮肤组织中的NKG2D+CD8+T细胞百分比增加,并且有助于攻击毛囊使其受损导致持久脱发[8-9];在斑秃急性期,血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞比例增加,而且NKG2D+CD8+T细胞可以迁移到皮肤中并驻留,从而发挥作用[10]。表明血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞比例增加是急性斑秃的关键影响因素,而皮肤组织中NKG2D+CD8+T细胞的积累是斑秃慢性发展的关键影响因素。本实验结果显示,模型组小鼠血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞比例较正常组明显升高,点阵激光联合侧柏叶酊组血液中NKG2D+CD8+T细胞比例较模型组及点阵激光组、侧柏叶酊组明显降低,点阵激光组、侧柏叶酊组NKG2D+CD8+T细胞比例与模型组比较变化不明显。提示1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗可明显抑制斑秃小鼠血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞比例的增加,但是二者单独治疗对NKG2D+CD8+T细胞比例影响不明显。

研究表明,IFN-γ水平与斑秃活性和疾病持续时间密切相关[11-12],IFN-γ可诱导主要组织相容性复合物Ⅰ类分子和Ⅱ类分子的滤泡表达,导致毛囊组织免疫豁免崩溃并诱导自身免疫性脱发[13],而阻断IFN-γ的功能可以抑制C3H/HeJ小鼠脱发的发生[9,14]。另外IFN-γ可促进损伤皮肤中的自反应CD8+T细胞产生IFN-γ,IFN-γ与其受体结合,从而激活Janus激酶信号换能器和转录途径激活器,刺激IFN-γ诱导的趋化因子表达[15]。Tang等[16]研究报道,利用小干扰RNA局部注射可以明显减少IFN-γ及其受体IFNGR1的表达,从而改善自身免疫性皮肤病。本实验结果显示,1 565 nm非剥脱点阵激光、侧柏叶酊单独应用及二者联合应用均能显著抑制C3H/HeJ小鼠毛囊组织中IFN-γ的表达,但是二者联合应用抑制IFN-γ表达的作用更强,且能明显抑制IFNGR1和IFNGR2的表达。这表明1 565 nm非剥脱点阵激光、侧柏叶酊单独应用或者联合应用均有改善斑秃的潜力,但是1 565 nm非剥脱点阵激光与侧柏叶酊联合应用抑制IFN-γ、IFNGR1和IFNGR2的表达作用更明显。

综上所述,环磷酰胺诱导的斑秃小鼠毛囊组织中IFN-γ信号通路被激活,血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞积累增加;1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊干预可以抑制IFN-γ信号通路和血液单个核细胞中NKG2D+CD8+T细胞的积累。本研究为1 565 nm非剥脱点阵激光联合侧柏叶酊治疗斑秃提供了新的理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。