基于吲哚的溶酶体荧光探针的合成及应用

陈 涛,梁梓健,桑亚男,王自瑶,柴方园,晏 可,张 璐,高 涛,3*

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院非动力核技术化学与生物学院;3.湖北科技学院辐射化学与功能材料湖北省重点实验室)

细胞内的pH对细胞正常生命活动至关重要,如信号传递[1]、离子转运[2]、细胞凋亡[3]等。许多疾病的发生发展都与细胞内pH的异常相关[4-5],因此,快速灵敏地监测细胞内pH值对阐明这些疾病的机制以及开发相应的治疗诊断工具具有重要意义。

传统的pH计仅适用于宏观流体,不能用于细胞以及亚细胞器的微环境pH监测。相比之下,由于荧光探针具有操作简单、灵敏度高、响应快、无创性等优点,使得其可以满足细胞中的监测要求[6-8]。pH探针的质子与探针的结合会导致荧光猝灭或者增强,其中荧光增强型探针比荧光猝灭型荧光探针更为准确,因为荧光猝灭可能是由实际样品中其他的物质干扰引起的[9],开发具有荧光信号增强型的荧光探针是一种有效的策略。

F16[(E)-4-(1H-吲哚-3-基乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物]是一种离域型亲脂性阳离子(DLC),常用于抗肿瘤药物的研究,这类分子可以在多种癌细胞中表现出细胞线粒体特异性积累,进而引发细胞凋亡或坏死[10]。而化合物(E)-3-(2-吡啶-4-乙烯基)-1H-吲哚(PVI)作为F16的前体结构,很少有人对其性能进行研究。但PVI分子仍保留有F16的大部分效应官能团,即具有较大的氮原子参与的共轭体系。这不仅使其具有较低能量激发的结构基础,而且可能对测定介质所带来的pH变化发生相应响应。本文研究了PVI的光学性质、荧光响应机制以及其细胞成像方面的应用。

1 材料与方法

1.1 仪器和材料

芦竹碱[1-(1H-indol-3-yl)-N,N-Dimethylmethanamine]购自上海易恩化学技术有限公司;4-吡啶甲醛(4-Pyridinecarboxaldehyde)购自上海阿拉丁试剂有限公司;正丁基膦(Tributylphosphane)购于上海安耐吉化学有限公司;石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯、乙腈、二甲亚砜等购自国药集团化学试剂有限公司。溶酶体红色荧光探针(Lyso-Tracker Red)购买自碧云天生物技术有限公司,PC-3细胞来自湖北科技学院基础医学院。

Bruker ASCEND 400MHz核磁;日立U3010紫外分光光度计;日立F4500荧光分光光度计;ELx800酶标仪;DYS2000倒置荧光显微镜;OLYMPUS FV3000激光共聚焦荧光显微镜。本实验所用的B-R(Britton-Robinson)缓冲液(含40nm乙酸、硼酸和磷酸)使用稀盐酸或氢氧化钠来调节pH值。

1.2 方法

1.2.1 探针PVI的合成

PVI的合成路线如图1所示。合成的化合物由芦竹碱348mg(2.00mmol/L)溶于15.0mL干燥乙腈中,常温下,加入4-吡啶甲醛0.400mL(4.00mmol/L)与正三丁基膦1.00mL(4.00mmol/L),80℃加热回流反应24h。TLC监测反应进程,待反应结束后旋干有机溶剂,得黑褐色油状物质。采用硅胶柱以石油醚∶乙酸乙酯=1∶1(v/v)分离纯化,得淡黄色粉末(PVI)。

图1 PVI的合成路线

1.2.2 光物理性质

在DMSO中制备探针PVI的储备溶液(10.0mmol/L),稀释至所需浓度。在日立U3010紫外分光光度计收集PVI在不同pH下的吸收光谱。荧光发射光谱由日立F-4500荧光光谱仪获得。将探针的储备溶液用B-R缓冲液稀释至不同的pH值进行测试(探针的最终浓度均为10.0μmol/L)。

1.2.3 DFT计算

使用高斯09软件包,采用密度泛函理论(DFT),使用B3LYP函数进行计算。在6-311G基组下,计算了PVI质子化前后的最优构象及其前线分子轨道(HOMO和LUMO)。

1.2.4 细胞成像

将PC-3细胞与10.0μmol/L的PVI培养基在5%CO2,37°C的条件下孵育30min。用PBS洗涤3次后,DYS2000倒置荧光显微镜捕获图像。

1.2.5 共定位实验

将培养好的PC-3细胞与PVI一起孵育(1.00μmol/L,60min),然后与溶酶体探针(LTDR,1.00μmol/L,20min)进一步孵育。用PBS洗涤3次后,OLYMPUS FV3000激光共聚焦荧光显微镜拍摄图像。绿色通道在λem=488nm处收集,红色通道在λem=561nm处收集。

2 结 果

2.1 PVI的合成

目标产物经芦竹碱与4-吡啶甲醛在正三丁基膦的催化下制备,产率为51%(淡黄色固体)。通过核磁共振波谱仪对所合成的化合物进行表征,确定了目标化合物的结构。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.50(s,1H),8.47(d,J=4.6Hz,2H),8.05(d,J=7.7Hz,1H),7.73(d,J=15.5Hz,2H),7.52(d,J=4.5Hz,2H),7.46(d,J=7.9Hz,1H),7.18(dd,J=9.6,7.7Hz,2H),7.07(d,J=16.6Hz,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ 149.71,145.84,137.12,127.87,127.28,125.03,122.02,120.22,120.04,119.91,119.86,113.18,112.03。

2.2 光物理性质

我们研究了不同pH值下PVI在B-R缓冲溶液中的吸收和发射光谱(图2)。如图2a所示,弱酸条件下(pH=7.00～4.00),PVI的最大吸收峰位于414nm处,其强度在酸性条件下随着pH值的减小而逐渐升高。在pH大于4时,荧光强度的增幅开始减缓。同时溶液颜色逐渐由无色变为黄色。化合物吸光度的变化是由于质子化后的PVI分子整体Π成键轨道与Π反键轨道能级缩小,跃迁概率增大所致。与此同时,在该吸收光波长上激发出的最大荧光发射峰位于527nm处,且荧光强度随着pH的减小而逐渐升高。这可能是因为质子化后的PVI分子的ICT效应受到阻碍,导致荧光增强。通过紫外吸收光谱和荧光发射光谱,我们可以明确,所合成的化合物PVI对溶液pH值具有较好响应能力,特别是酸性条件下化合物的荧光强度明显增强。因为溶酶体是一种具有酸性微环境的细胞器,所以探针PVI具有潜在的溶酶体内发光和成像的能力。

图2 PVI(10.0μmol/L)在365nm下不同pH的BR溶液中的发射(a)和在日光灯下吸收光谱(b)

2.3 探究荧光响应对pH影响的潜在机制

为了探究荧光响应对pH的潜在机制,对PVI质子化前后的分子构型和HOMO/LUMO能级分布进行了密度泛函(DFT)分析。如图3所示,PVI是一个大共轭平面。其中吲哚环上的氮原子孤对电子也参与共轭体系的构建,而吡啶环则不然。吲哚环上的氮原子比吡啶环上的氮更容易被质子化,所以吲哚环上的氮原子先被质子化(图4)。随后,研究了相应结构的HOMO/LUMO能级分布(图4)。质子化后PVI的HOMO和LUMO在分子中分布较多,导致ICT效应被抑制使荧光增强(图5)。PVI质子化后的HOMO和LUMO轨道之间的能量间隙(Eg)逐渐减小,这与它们的荧光发射峰红移的结果一致。上述研究确定了PVI在酸性条件的发光机制,该结果对PVI的应用奠定了坚实的理论基础。

图3 PVI优化后的构型

图4 PVI质子化前后的HOMO/ LUMO以及能量间隙(Eg)

图5 PVI荧光响应机理

2.4 活细胞中的荧光成像

MTT测定用于检查探针的细胞毒性。以10.0μmol/L的PVI与PC-3细胞共同孵育48小时的细胞仍然显示出相当高的活力。良好的生物相容性促使我们进一步研究它们在活细胞中的荧光成像。将浓度为1.00μmol/L的PVI与PC-3细胞共同孵育30min。如图6所示,通过MTT和细胞成像实验,我们可以确定的是,化合物的细胞毒性低,能够在细胞中长时间发挥作用而不损伤细胞,满足细胞及生物体中应用的前置条件。从细胞的成像效果我们可以发现,细胞的结构和形貌依然清晰完整,且呈现明亮的绿色荧光,说明PVI具有较好的生物相容性和细胞成像能力。

图6 用10.0μmol/L的PVI与PC-3细胞共同孵育30min后荧光显微镜图像(a、b、c为荧光图,a1、b1、c1为明场)

2.5 溶酶体共定位

溶酶体是细胞中重要的细胞器,是细胞的“化工厂”,具有控制细胞凋亡的能力。因溶酶体具备独特的消化功能,使得其内部始终保持酸性的微环境,具有较强的嗜碱能力,能吸收和吸附碱性小分子。PVI分子具有吡啶和吲哚结构,因此,分子自身具有较强的碱性,具有被溶酶体识别和吸附的能力。为了进一步验证PVI在细胞中的空间分布情况,我们通过激光共聚焦显微镜结合溶酶体商品染料(LTDR),研究了PVI的溶酶体定位能力。选用PC-3细胞作为研究对象,先用PVI孵育然后用LTDR进行处理。再通过激光共聚焦显微镜进行实时成像。如图7所示,PVI发绿色荧光,LTDP呈现红色荧光,共定位分析表明,皮尔逊相关系数Pr=0.909,表明PVI和LTDP发光区域重叠性非常好。PVI可以在PC-3细胞中成像,能够在溶酶体中积累,且发出明亮的绿色荧光。说明PVI是一种较好的溶酶体荧光探针,具有潜在的商业应用价值。

a.PC-3细胞用1.00μmol/L的PVI染色1h;b.PC-3细胞用1.00μmol/L LTDR染色20min;c.PC-3的明场;d.是a,b,c的重叠图;e.PVI和LTDR的皮尔逊相关系数;f.PC-3细胞ROI的荧光强度图,绿线代表PVI的强度,红线代表LTDR的强度。图7 PC-3细胞的荧光共定位实验

3 讨 论

我们通过吲哚和吡啶成功构建了一种小分子化合物PVI,其具有较好光物理性质,且荧光强度对pH有很强的依赖性,在酸性环境中能够发出明亮的绿色荧光。探针PVI的DFT计算结果表明,质子化后的PVI通过抑制ICT效应实现了pH荧光增强,是PVI在酸性条件发光的主要作用机制。PVI的MTT和细胞成像实验结果表明,所合成的探针生物相容性好,细胞毒性低,能够在细胞中发出明亮的绿色荧光。进一步的共聚焦成像实验结果表明,探针具有较好的溶酶体定位能力,能有效的在溶酶体中聚集并发出绿色荧光。

综上,我们合成得到了一种pH响应的荧光探针PVI,具有细胞毒性低、生物相容性好、荧光强度大的优点,能用于溶酶体定位和成像,是一种具有商业应用价值的溶酶体荧光探针。