山楂叶番石榴叶复合发酵饮料的工艺优化

于晓庆，周铭懿，郭雪松

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121000）

山楂叶能够促进血液循环，消除淤血，调理气血流通，降低血脂[1]，富含黄酮类、多糖类、三萜类等多种化合物[2]，具有较强的抗氧化和抗自由基活性[3]。番石榴叶是指属于番石榴科植物在干燥状态下的叶子或者带有叶子的新鲜茎。在一些国家，番石榴叶具有传统民间医药用途，可治疗多种常见疾病，如风湿病、腹泻、糖尿病和咳嗽等。多项研究显示，番石榴叶具有对抗糖尿病的活性成分[4]。

植物乳杆菌具有较高的活菌数量，可以大量产酸，从而最大程度缩短发酵周期[5]，且由于耐酸性好，大部分菌种在胃液、胆汁内可以存活并发挥功效，因此在制作复合发酵饮料时选择更为适合的植物乳杆菌作为发酵剂。山楂叶和番石榴叶经过植物乳酸杆菌发酵研制复合发酵饮料，为山楂叶和番石榴叶的精细加工和全面利用提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂叶、番石榴叶（干叶，亳州市益寿山药业有限公司）；白砂糖（食品级，南京甘汁园股份有限公司）；海藻酸钠（食品级，青岛明月海藻集团有限公司）；植物乳酸杆菌（上海微生物保藏中心）。

乳酸菌培养基：MRS培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

101-1型电热鼓风干燥箱（上海喆钛机械制造）；FW-100型高速万能粉碎机（东莞市房太电器有限公司）；M4-AL204型电子分析天平（北京天星科仪科技有限公司）；OSP-520E型超声波清洗机（石家庄奥斯派机械科技有限公司）；DE-52CS型离心机（广州吉迪仪器有限公司）；YX-280B型高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；CJ-840型水平超净工作台（东莞市弘维净化科技有限公司）；DHP-9082型恒温培养箱（上海捷呈实验仪器有限公司）；RM-755B型紫外分光光度计（青岛瑞明仪器设备有限公司）；YY-400型pH计（上海三信仪表厂）；GJJ-0.06/100型均质机（东方化玻科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程原料叶→清洗去杂→烘干→粉碎→浸提→离心→接种→发酵→配料→均质→成品

1.3.2 浸提液的制备

选择表面整洁、无霉变和虫蛀的山楂叶和番石榴叶，用清水冲洗3遍除去其表面的杂质，在80 ℃烘箱中烘干。将烘干后的山楂叶和番石榴叶用粉碎机粉碎成粉末状，过0.425 mm（40目）筛，分别以料水比1∶20（g/mL），在70 ℃条件下进行超声波辅助浸提60 min。浸提液经离心后取上清液，备用。

1.3.3 菌种的活化

植物乳杆菌的活化及扩大培养：配制100 mL的MRS肉汤培养基，在121 ℃下灭菌15 min后冷却至40℃左右；将甘油保存的植物乳杆菌在超净工作台上转移到MRS肉汤培养基中，并且放置在恒温培养箱中以37±1 ℃的温度培养48 h；将3 mL培养液取出后，转移到新的MRS肉汤培养基中，并将其放置在恒温培养箱中（温度37±1 ℃）进行48 h培养，得到活化2次的植物乳杆菌悬液，备用。

1.3.4 山楂叶番石榴叶复合发酵饮料的制备

将活化后的植物乳杆菌悬液加入浸提液中并充分搅拌混合后放入恒温培养箱中进行一段时间的发酵，完成发酵后，以总浸提液的体积为基数加入5%白砂糖、0.25%海藻酸钠，进行2次25 MPa的均质处理后得到成品。

1.3.5 植物乳杆菌发酵单因素试验

在乳酸菌发酵过程中，随着发酵液中乳酸菌不断繁殖，乳酸菌数量逐渐增多，根据白长胜等[6]运用吸光度法快速进行乳酸菌活菌计数的研究，乳酸菌发酵液在600 nm波长下测得的吸光度能反映乳酸菌发酵过程中乳酸菌活菌数的数量，因此单因素试验以A600（发酵液在600 nm波长下测得的吸光度）为指标考察发酵条件。单因素试验条件设置：以发酵后饮料的A600为评价指标，固定接种量4%、发酵时间36 h，设置发酵温度31，33，35，37和39 ℃，探究发酵温度对饮料A600的影响；固定发酵温度37 ℃、发酵时间36 h，设定植物乳杆菌的接种量2%，3%，4%，5%和6%，探究接种量对饮料A600的影响；固定乳杆菌接种量4%、发酵温度37 ℃，将原料浸提液分别发酵36，40，44，48和52 h，探究发酵时间对饮料A600的影响。

1.3.6 发酵工艺优化

基于单因素试验，根据发酵液的A600，使用Box-Behnken设计响应面试验优化发酵工艺参数。响应面试验因素水平如表1所示。

表1 响应面因素水平表

1.3.7 产品质量指标检测

1.3.71 pH的测定

采用pH计测量复合发酵饮料的pH。

1.3.72 总酸的测定

根据GB 12456—2021《食品中总酸的测定》[7]测定饮料总酸。

1.3.73 可溶性蛋白含量的测定

根据可溶性蛋白试剂盒使用说明，使用双缩脲法测定饮料中可溶性蛋白含量。

1.3.74 微生物指标测定

乳酸菌活菌数的测定，根据 GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》[8]进行乳酸菌的测定；根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数的测定》[9]方法，对饮料中乳酸菌活菌数进行测定；大肠菌群的测定，根据GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[10]测定饮料大肠菌群；霉菌和酵母菌测定，根据GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母菌计数》[11]测定饮料霉菌和酵母菌。

1.3.8 感官评价

感官评价采用百分制的评分方法，请15位品评人员参照表2的感官评价标准对制作的复合发酵饮料进行评价，评价内容包括组织状态、口感、气味和整体接受度4个方面，评价标准采用无记名打分方式。

表2 复合发酵饮料的感官评价标准

1.3.9 数据处理

各试验平行重复3次，以“平均值±标准偏差”的形式描述试验结果。以P＜0.05计为统计具有显著性差异，P＜0.01计为统计差异极显著。用Design-Expert 13.0统计软件对数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵最佳工艺参数

2.1.1 接种量对复合发酵饮料A600的影响

如图1所示，A600随着接种量的增加而增加。接种量超过5%后，A600没有明显变化。这是由于植物乳酸杆菌不断繁殖，导致乳酸产量增加，发酵液的pH下降，从而抑制乳杆菌的生长。因此，选取接种量较低、A600较高的发酵条件，即选择5%作为适宜的接种量。

图1 接种量对A600的影响

2.1.2 发酵时间对复合发酵饮料A600的影响

从图2可以观察到，复合发酵饮料的A600随着发酵时间的延长而增加，发酵时间44 h后，A600的增加量逐渐趋于稳定。这是因为植物乳杆菌利用原料中的碳水化合物不断产酸，不断提高的酸度及其代谢产物对植物乳杆菌的生长起到抑制作用，降低其繁殖速度。初步考虑，发酵时间约44 h。

图2 发酵时间对A600的影响

2.1.3 发酵温度对复合发酵饮料A600的影响

由图3可得，发酵温度过低或过高均会抑制植物乳杆菌的生长，发酵温度保持在35 ℃时，复合发酵饮料的A600达到最高值，同时饮料中的活菌数也达到最高水平，因此，选择发酵温度35 ℃。

图3 发酵温度对A600的影响

2.2 发酵工艺响应面试验结果与分析

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

基于单因素试验，在复合发酵饮料中，以A600作为指标，进行响应面试验优化发酵工艺参数，参数包括接种量、发酵时间和发酵温度。表3展示响应面试验的设计和结果。

表3 响应面优化试验设计及结果

利用Design-Expert 13.0软件对表3中的A600进行回归拟合，得到二次多项回归方程：A600=0.650 6+0.022 3A+0.019 4B+0.025 6C-0.000 3AB+0.005 8AC+0.004 5BC-0.048 6A2-0.060 3B2-0.122 8C2。

2.2.2 回归模型有效性及显著性

对响应面模型进行显著性分析，结果如表4所示。

表4 回归模型的方差分析

结果表明：回归模型F=712，模型P值＜0.01，说明回归模型极显著；失拟项P值＞0.05，为不显著，模型合理。决定因素R2=0.998 9，这说明回归方程具有良好的拟合性，能有效描述因素与响应值之间的关系；Radj2=0.997 5，表明试验误差小，可靠性高。在回归模型中，一次项和二次项的显著性非常高，P值小于0.000 1，对A600均有极显著影响。通过F值，可以判断植物乳杆菌发酵山楂叶番石榴叶复合饮料A600的结果受到发酵温度、接种量和发酵时间3个考察因素的影响程度，按照大小顺序排列为发酵温度＞接种量＞发酵时间。

2.2.3 响应面因素交互作用分析

在对复合发酵饮料A600的影响进行综合考察时，通过将其中1个因素保持不变，选择其他2个因素观察它们对A600的影响。通过Design-Expert 13.0软件对表3中的数据进行分析，得出等高线图和响应曲面。

从图4可以观察出，植物乳杆菌的发酵参数呈现为椭圆形等高线图，揭示接种量和发酵温度之间有明显交互作用，通过增大这2个因素，观察到A600呈先升高后下降的趋势。通过观察响应曲面图，可以发现增加发酵温度对A600影响更明显，相比之下增加接种量对A600的影响较小，说明发酵温度对A600影响较大。

图4 接种量和发酵温度的响应曲面图（左）和等高线图（右）

根据图5可以观察到，植物乳杆菌的发酵温度和发酵时间的等高线图形呈不明显的椭圆形状，这表明发酵时间和发酵温度2个因素之间的相互影响作用较小。发酵时间和发酵温度逐渐增加，导致A600先增加后减少，但发酵温度的增加幅度显著高于发酵时间，表明发酵温度对A600有更大影响。

图5 发酵温度和发酵时间的响应曲面图（左）和等高线图（右）

从图6可以看出，植物乳杆菌的发酵时间和接种量之间的相互作用不明显，它们的等高线图形呈现一个不明显的椭圆状。这表明发酵时间和接种量这2个因素之间的相互影响并不显著。随着植物乳杆菌接种量和发酵时间的增加，A600的测量值呈现先增加后减少趋势。通过观察该响应曲面，可以发现它们的上升幅度相似，即2个因素对A600的影响程度相当。

图6 接种量和发酵时间的响应曲面图（左）和等高线图（右）

3个因素之间的相互作用及对A600的影响与方差分析结果一致，运用Design-Expert 13.0软件得出该数据模型的最大值点，即植物乳杆菌发酵复合饮料的最佳生产工艺条件为接种量5.235%，发酵温度35.225℃，发酵时间44.659 h，最大A600为0.656。为方便试验操作，对发酵条件进行调整和优化，即接种量5%，发酵温度35 ℃，发酵时间44 h。通过对优化后的试验条件进行3次验证试验，测定其A600并得到平均值0.651±0.004。与模型预测值相比，误差仅0.76%，这表明试验结果与预测值的符合程度相当良好。因此，Box-Behnken设计不仅方案准确可靠，而且具有可操作性，能够确保各个因素的添加量被准确把握。

2.2.4 产品质量指标检测结果

根据1.3.7产品质量指标检测中方法进行检测，结果如表5所示。

表5 产品质量指标检测结果

由表5可知：复合发酵饮料中可溶性蛋白质含量为0.32±0.01 mg/mL，乳酸菌总数为1.9±0.2×107CFU/mL，总酸度为0.31±0.03 g/L，大肠杆菌、酵母菌、霉菌数均符合国家标准要求。

2.2.5 感官评价结果

由图7可以看出，15位品评人员中大部分认为该复合发酵饮料无异味，酸甜适中，口味纯正，风味良好，具有山楂叶番石榴叶的清香。

图7 感官评分

3 结论

以植物乳杆菌作为发酵剂对山楂叶和番石榴叶的浸提液进行发酵以制备复合饮料，最佳发酵工艺参数为接种量5%、发酵时间44 h、发酵温度35 ℃，在此条件下制备的发酵饮料A600为0.651±0.004，得到的复合发酵饮料酸甜可口，风味良好，大肠杆菌、酵母菌、霉菌数均符合国家标准要求。