乳酸菌发酵杜仲香菇酱的工艺研究及营养分析

王秀梅，马新辉，李照华

三门峡市质量技术监督检验测试中心（三门峡 472000）

香菇营养价值丰富，富含多糖[1]、蛋白质[2]、矿物质[3]、核酸等多种营养成分，具有抗氧化、改善肠道[4]、降低血脂[5]等多种生理功能，具有很好的营养价值。三门峡地处豫西，是重要的香菇种植基地，已育有豫香1号香菇，产量和品质极高[6]。我国的香菇产品的类型少，常见的有香菇脆片[7]、香菇酱[8]、香菇饮料[9]、香菇面条[10]等。这些产品工艺简单、附加值低[11]，没有充分发挥香菇的营养价值和经济价值[12]。因此，开发一种高营养、高附加值的香菇产品尤为重要。

嗜酸乳杆菌是一类微耗氧的革兰阳性无芽孢细菌，其代谢产物能抑制大肠杆菌的异常发酵，从而预防便秘、腹泻。聂远洋等[13]发现乳酸菌发酵香菇可以不同程度增加小鼠肠道内益生菌群，从而改善肠道健康。刘丽娜等[14]研究结果表明，乳酸菌发酵香菇柄可以增加膳食纤维、蛋白质和总酸含量，提高香菇的营养价值和保健功能，为开发乳酸菌发酵香菇柄的香菇制品提供了理论依据。杜仲药食两用补肝肾，富含木脂素类、京尼平苷酸、绿原酸、总黄酮类、氨基酸等营养成分和生物活性成分，能够促进嗜酸乳杆菌发酵产生更多的有机酸、甘露聚糖肽和可溶性乳酸钙，长期食用后有益于人体肠道健康、补钙和提高免疫力。试验以香菇为原料，探究添加杜仲对乳酸菌发酵香菇及其代谢产物的影响，添加三酱和大豆油，辅以香辛料进行炒制，得到一款富含乳酸菌和乳酸钙的复合风味调味酱。

1.1 材料与设备

香菇（三门峡市永辉超市）；豆酱（海天黄豆酱）；豆豉（灵宝乡亲食品厂）；甜面酱（陕州甜面酱）；杜仲。

嗜酸乳杆菌标准菌株（中国微生物菌种保藏中心CCIC 22162嗜酸乳杆菌）。

7820A气相色谱仪（美国安捷伦）；BHC-1300ⅡA/B3生物洁净安全柜（吴江市净化设备总厂）；DHZC全温振荡器（太仓豪诚实验仪器厂）；PHS-3C型pH计（上海精密科雷磁仪器有限公司）；1.0 m2冷冻干燥设备（上海东富龙科技股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 乳杆菌发酵剂的制备

1.2.11 培养基的制备

称取10 g蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母膏、5 g氯化钠、10 g葡萄糖和10 g碳酸钙，加水至1 000 mL；加热90 ℃溶解后用20%氢氧化钠溶液调整pH 6.8，分别装入试管和三角瓶（斜面试管培养基另外加1%～2%的琼脂），分别将棉塞和防潮纸进行包扎；于120 ℃蒸汽灭菌25 min，冷却后置于37 ℃恒温培养箱中备用。

1.2.12 活化培养

将标准品菌种转入液体试管培养基，置恒温培养箱37 ℃活化培养24 h；将生长良好的液体试管，用铂金饵钩取菌液，划线斜面数支或数十支，置恒温培养箱于37 ℃培养24 h，取菌苔生长良好的作为生产用斜面菌种，放置冰箱备用；每天取1支斜面菌种，分别接种1级试管和2级三角瓶培养基，于37 ℃恒温培养24 h；将生长良好的三角瓶（2级）液体发酵培养基转接5 000 mL圆底烧瓶（配制3 000 mL）10%脱脂牛奶混合培养基中，培养基添加7%～8%蔗糖，1%谷氨酸、1%维生素C和1%碳酸钙作为保护剂和缓冲剂，同样置恒温培养箱于37 ℃培养16 h，每隔1 h摇瓶1次，并观察碳酸钙消失情况。

1.2.13 冻干制剂

发酵终点pH 4.0时，将3级培养发酵液置真空冷冻干燥机组，于-45～50 ℃进行真空冷冻干燥并按无菌操作程序收集冻干菌粉称量，即得嗜酸乳酸杆菌发酵剂。

1.2.2 添加杜仲的乳杆菌发酵剂的制备

杜仲提取物的制备：定量称取杜仲叶（揉碎），按1︰1加入纯净水浸润2 h，第1次料液比按1︰6（g/mL）加入纯净水，控制加热温度95 ℃加热提取1 h，第2次料液比按 1︰4（g/mL）加入纯净水，控制加热温度95 ℃加热提取40 min；合并2次提取液，然后放置真空冷冻干燥机组，于-50 ℃进行真空冷冻干燥并按无菌操作程序收集冻干粉，即得杜仲提取物。培养基的制备过程添加10 g杜仲提取物，其余操作同1.2.1。

1.2.3 工艺流程

CCIC 22162嗜酸乳杆菌标准菌种活化、筛选、斜面保藏→转一级、二级杜仲提取物强化培养→低温冷冻干燥乳酸菌高效发酵剂→接种香菇丁固态发→45 ℃低温混合搅拌炒制好的三酱→乳酸菌发酵杜仲香菇复合调味酱

1.2.4 添加杜仲对发酵香菇的影响

分别将未经杜仲提取物强化的嗜酸乳杆菌发酵剂和添加杜仲提取物的嗜酸乳杆菌发酵剂加入香菇丁的水溶液中，香菇与水质量比1︰1，发酵剂接种量为香菇质量的8%。调节pH 6.8，在37 ℃发酵120 h，每隔24 h测定发酵液中的活菌总数、pH和乳酸钙含量。

1.2.5 发酵香菇复合调味酱的工艺优化

三酱（豆瓣酱、甜面酱、豆豉）按1︰1︰1的配比进行炒制，炒出红油后，5 min后，依次放入称好的辣椒、洋葱和大蒜、花椒、白糖；油温达到190 ℃时，加入称好的食盐和味精进行加温，把温度慢慢升到260 ℃时，关火炒制；油温降到80 ℃后，把温度慢慢升到230 ℃，炒出酱香味持续炒5 min，关火降温，降温至45 ℃。加入预先发酵好的香菇丁充分混合均匀后，即为发酵香菇酱。

基础配方：发酵香菇56%，三酱（甜面酱、豆瓣酱、豆豉质量比1︰1︰1）25%，大豆油8%，辣椒、味精、洋葱、大蒜各2%，花椒、白糖、食盐各1%。

分别选取发酵香菇添加量（48%，52%，56%，60%和64%）、三酱添加量（19%，21%，23%，25%和27%）和大豆油添加量（6%，7%，8%，9%和10%）为3个变量，进行单因素试验。

在单因素试验基础上，以发酵香菇添加量、三酱添加量和大豆油添加量为三因素，以感官评分为指标，进行响应面试验研究，因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平表 单位：%

1.2.6 感官评分

由10名食品专业人士组成感官评定小组，对香菇酱进行色泽、口感、气味和组织状态进行评定[15]，评分标准见表2。

表2 感官评分标准

1.2.7 营养成分的测定和理化指标

蛋白质按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》测定；脂肪按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》测定；膳食纤维按照GB 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》测定；水分按照GB 5009.3—2010《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定；灰分按照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》测定；碳水化合物按照GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》计算获得，碳水化合物=100-蛋白质、脂肪、水分、灰分、膳食纤维的质量；乳酸菌活菌数按照GB 4789.35—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定；乳酸钙按照GB 5009.92—2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》测定。

1.3 数据处理

每组试验重复3次，试验结果采用“平均值±标准偏差”表示；试验结果用Origin 9.0软件进行处理和绘图；响应面试验使用Design-Expert 7.0.0设计分析。

2 结果与分析

2.1 添加杜仲前后香菇发酵变化

2.1.1 添加杜仲前后活菌总数随时间的变化

以发酵时间为横坐标，以活菌总数的对数为纵坐标，活菌总数随时间的变化见图1。结果表明，接种24 h内，活菌数量急剧下降，这是因为发酵剂中的嗜酸乳杆菌刚进入新的发酵环境不适应。24 h后，随着发酵时间的增加，活菌总数逐渐增加。96 h时，活菌总数最多，添加杜仲提取物的发酵液中乳酸菌总数6.4×108CFU/g，未添加杜仲提取物的发酵液中乳酸菌总数为2.8×108CFU/g，这说明添加杜仲提取物对发酵有促进作用。与贾亚娟等[16]的研究相比，活菌数达到最大所需时间较长，这可能是由于发酵初期香菇丁颗粒较大，嗜酸乳杆菌不能很好地利用。24 h后，活菌适应环境，呈对数生长趋势。96 h后，由于营养物质减少和次级代谢产物的增多，营养物质缺乏，乳酸菌活菌总数呈减小趋势。

图1 添加杜仲前后菌数随时间的变化

2.1.2 添加杜仲前后pH随时间的变化

添加杜仲前后pH随时间的变化结果见图2。结果表明，随着发酵时间的增加，乳酸等有机酸发酵产物增加，pH逐渐降低，发酵96 h，pH下降至3.8。0～24 h，pH下降速度明显低于24～72 h；96～120 h，pH不再下降。

图2 添加杜仲前后pH随发酵时间的变化

2.1.3 添加杜仲前后乳酸钙随时间的变化

以发酵时间为横坐标，可溶性乳酸钙含量变化结果见图3。结果表明，随发酵时间的增加，乳酸钙含量先增加后趋于稳定。发酵96 h时，乳酸钙含量最高，添加杜仲提取物的发酵液中乳酸钙含量可达2.2%，未添加杜仲提取物的发酵液中乳酸钙含量为2.1%，添加杜仲提取物能增加发酵液中的乳酸钙含量，但增量较小。120 h后乳酸钙含量不再增加，这说明整个发酵体系不再产酸，乳酸钙产量达到饱和状态，这与pH变化的结果一致。

图3 添加杜仲前后乳酸钙随发酵时间的变化

2.2 调味工艺单因素试验结果

2.2.1 发酵香菇添加量对香菇复合调味酱感官评分的影响

发酵香菇添加量对香菇复合调味酱感官评分的影响见图4。结果表明，随着发酵香菇添加量的增加，感官评分先增加后减少，发酵香菇添加量56%时感官评分最高。发酵香菇中含有大量的乳酸、酸味氨基酸、鲜味氨基酸和芳香味氨基酸[17]。发酵香菇添加过少，鲜味香味不足；发酵香菇添加过多，酸味过重，遮盖了产品的其他风味，评分降低。

图4 发酵香菇添加量对感官评分的影响

2.2.2 三酱添加量对产品品质的影响

三酱添加量对产品品质的影响见图5。三酱添加量低于23%，由于添加量过少，调节酸味的作用较低，复合调味酱口感较差。三酱添加量高于23%时，咸味偏大，评分降低。

图5 三酱添加量对感官评分的影响

2.2.3 大豆油添加量对产品品质的影响

大豆油添加量对产品品质的影响见图6。随着大豆油的添加量的增加，感官评分先增加后减少。大豆油含量低于8%，香味物质较少；大豆油含量高于8%时，复合调味酱偏腻，评分降低，口感较油腻，也不利于人体健康。因此，大豆油最佳添加量为8%。

图6 大豆油添加量对感官评分的影响

2.3 响应面试验设计及感官评分结果

响应面试验的感官评分见表3。发酵香菇复合调味酱的感官评分与3个因素的回归方程式为Y=87.80+1.56A+0.13B+0.44C-1.88AB-0.75AC+1.12BC-2.15A2-3.53B2-1.40C2。由表4可知，回归模型中R2为0.997 2，P＜0.000 1，说明模型拟合度高，可靠性好，可以用此方程预测3个因素对发酵香菇复合调味酱感官评分。由一次项式F值可知，各因素对发酵香菇复合调味酱的感官评分影响依次为发酵香菇添加量＞大豆油添加量＞三酱添加量。

表3 响应面试验的感官评分

表4 响应面模型方差分析

2.4 最佳工艺条件试验验证

通过响应面优化，系统推测出发酵香菇复合调味酱的最佳工艺，即香菇添加量58%、三酱添加量23%、大豆油添加量8%，感官评分为88分。经过3次验证，实际感官评分为88分。

2.5 发酵复合调味酱的营养成分及理化指标

发酵香菇复合调味酱的营养成分见表5。发酵香菇复合调味酱含有丰富的蛋白质和膳食纤维，且含有1.2%的乳酸钙。发酵香菇复合调味酱在提供人体必需的能量物质的同时，还可以补充钙元素。此外，乳酸菌活菌数可达4.0×108CFU/g，可以调节人体肠道功能，有益人体健康。发酵香菇复合调味酱是一款新型健康的调味食品。为更好保持乳酸菌的活菌数量和营养成分，这款产品需在0～4 ℃冷藏保存。

表5 香菇酱中营养成分及含量

3 结论

乳酸菌发酵剂在添加杜仲提取物后，发酵香菇的活菌数量增加1倍，这说明添加杜仲提取物对香菇发酵有强化作用。发酵杜仲香菇复合调味酱的最佳配方为发酵香菇添加量58%，三酱添加量23%，大豆油添加量8%。按此配方下得到的乳酸菌香菇酱色泽红润，香味浓郁，营养和安全指标均符合国家标准，且富含乳酸菌和乳酸钙。