亚临界丁烷萃取副产物槟榔芯中槟榔碱的工艺优化

孙建，康宗华 ，刘群，江露，李明丹

1.湖南口味王集团有限责任公司（益阳 413000）；2.新药药效与安全性评价湖南省重点实验室（长沙 410300）

槟榔属于棕榈科槟榔属多年生常绿乔木，在中国海南、台湾等地都有分布。海南全省槟榔种植面积7.92万 hm2，年产值20多亿元[1]。2022年全省槟榔总产量29.48万 t，比上年增加6.7%[2]。

全世界约有6亿人在食用槟榔嚼块，我国主要以嚼食果壳加工产品为主[3]。每年约有10万 t果芯被废弃，果芯资源的进一步开发利用变得迫在眉睫。

以槟榔碱为主的生物碱类是槟榔中特征功效成分，其具有驱虫[4-5]、辅助改善记忆[6]、抗炎及提升免疫[7]、抑制骨质疏松[8]、促进胃肠活力[9-10]、抵抗焦虑[11]、提神醒脑[12]等功效。康丽如等[13]采用响应面法优化亚临界水提取果芯中槟榔碱的工艺，提取率可达4.25 mg/g。罗士数[14]分别采用乙醇回流法、超声波提取法及超临界CO2萃取法提取槟榔鲜果中槟榔碱，证实3种工艺所得槟榔碱有很好抑菌作用。此外，还有微波预处理结合超临界CO2流体萃取工艺研究报告[15]。

低温亚临界萃取技术是一种新型萃取分离技术，被广泛用于油脂制取及脱脂产品开发等领域[16-19]。亚临界状态的丁烷扩散性强、传质速度快、溶解能力高，常被用于油料中油脂的快速萃取和组分分离[20]。

以亚临界丁烷萃取技术对副产物槟榔芯中的槟榔碱进行萃取，结合单因素试验和Box-Behnken响应面法优参数，以期为工业规模化应用及槟榔资源的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试药

槟榔芯（湖南口味王集团有限责任公司）；正丁烷溶剂（纯度≥99.6%，长沙柘长气体有限公司）；对照品槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯；磷酸、氨水（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

WT30002KE电子秤（常州万泰天平仪器有限公司）；运邦YB-1000A型多功能粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）；DZF-6020型台式真空干燥箱（中新医疗仪器有限供公司）；不锈钢筛网（0.850 mm，约20目，绍兴市上虞华丰五金仪器有限公司）；DWCQ-20L亚临界低温萃取设备（安阳市晶华油脂工程有限公司）；岛津Nexera XR高效液相色谱系统（日本SHIMADZU公司）；ME2002E/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 槟榔碱萃取工艺

将槟榔芯副产物依次进行干燥、破碎、过筛处理，称取适量并记录质量（g），用适量碱液处理，装入0.074 mm（200目）尼龙滤袋内，包扎严实。打开萃取设备的罐口，放入萃取罐中，同时上好螺丝把罐封闭好；开真空泵排气，把萃取罐内的压力抽至-0.08 MPa后，开溶剂罐罐底溶剂阀向萃取罐注入适量丁烷溶剂。打开夹套热水阀门进行升温，至萃取罐内的温度达到试验温度后开始计时，浸泡萃取。待萃取结束后，打开萃取罐底部阀门，把混合油放入蒸发罐内。开启蒸油阀、冷凝器阀门，依次开启压缩机和真空泵，进入脱溶工序。待溶剂回收完全，缓慢打开蒸发罐排空阀，破真空至常压后，开放油阀放萃取物料，记录萃取物质量（g）。

1.3.2 单因素试验方案

按1.3.1的方法进行提取，考察萃取次数（1，2，3，4和5次）、萃取时间（10，20，30，40，50和60 min）、萃取温度（35，40，45，50和55 ℃）和液料比（4︰1，6︰1，8︰1，10︰1和12︰1 mL/g）4个因素在不同水平下对槟榔芯中槟榔碱萃取率影响，每组重复3次。

1.3.3 响应面优化试验设计

采用软件Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken试验设计，根据单因素试验，选取萃取时间（A）、液料比（B）和萃取温度（C）3个因素为自变量，槟榔碱萃取率（mg/g）为响应值。为简化试验周期，按萃取1次进行后续试验。3个自变量因素水平如表1所示。

表1 响应面优化试验因素水平表

1.3.4 槟榔碱含量测定

1.3.41 供试液制备

精密称取20 mg各批次萃取物，用甲醇-0.5%磷酸水溶液1︰1（V/V）的混合溶液进行溶解并定容至25 mL容量瓶中，过0.22 μm有机滤膜后供高效液相色谱仪测定，结合对照品谱图计算样品中4种槟榔生物碱含量（mg/g）。

1.3.42 色谱条件

参考药典中方法，色谱柱为Ultimate®XB-SCX强阳离子交换色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.3%磷酸水溶液（氨水调节pH 3.8）55︰45（V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长215 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

1.3.5 槟榔碱萃取率（mg/g）的计算（式1）

式中：W为槟榔碱萃取率，mg/g；m0为萃取得到萃取物质量，g；c为萃取物经HPLC检测后得到槟榔碱含量，mg/g；m为试验时所称槟榔芯粉末质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取次数对萃取效果的影响

在液料比8︰1（mL/g）、单次萃取时间30 min、萃取温度45 ℃条件下，分别考察萃取1，2，3，4和5次对物料中槟榔碱萃取效果影响。

由图1可以看出，在1～4次萃取操作下，萃取率不断增大。但萃取4次和萃取5次，萃取率差别不大，表明物料中槟榔碱已得到充分萃取，继续增加萃取次数已无实际意义。因此，选择4次萃取即可满足工艺要求。

图1 萃取次数对槟榔碱萃取率影响

2.1.2 萃取时间对萃取效果的影响

在液料比8︰1（mL/g）、萃取次数1次、萃取温度45 ℃条件下，考察萃取时间（10，20，30，40，50和60 min）对槟榔碱萃取效果影响。

由图2可以看出，萃取时间在10～30 min范围内，随着时间的延长，槟榔碱萃取率快速升高。浸提30～60 min，萃取率几乎保持不变，整体趋势与花椒精油亚临界萃取工艺的报道[21]相似。考虑工艺整体效率，单次萃取时间选择30 min较合适。

图2 萃取时间对槟榔碱萃取率影响

2.1.3 萃取温度对萃取效果的影响

在萃取时间30 min、萃取次数1次、液料比8︰1（mL/g）条件下，考察不同萃取温度对槟榔碱萃取效果影响。

如图3所示，萃取体系温度在35～45 ℃范围内，随着温度的升高，槟榔碱萃取率不断增大。继续调高体系温度（45～55 ℃），萃取率有所减小。这可能是萃取体系适当加温有助于溶剂分子和槟榔碱分子的热运动加快，促进分子间相互碰撞，导致槟榔碱易于溶解至溶剂中，表现为萃取率增大[22]。但萃取体系过高的加温则使液态丁烷溶剂液体密度降低，不利于目标成分的萃出[23]，或者因为温度的升高，导致物料内其他脂溶性成分浸出，进而影响槟榔碱成分的萃取[24]。

图3 萃取温度对槟榔碱萃取率影响

图4 液料比对槟榔碱萃取率影响

2.1.4 液料比对萃取效果的影响

在萃取时间30 min、萃取次数1次、萃取温度45℃条件下，考察不同液料比对槟榔碱萃取效果影响。

液料比4︰1～8︰1（mL/g）范围内，槟榔碱萃取率随着液料比的增加快速升高。液料比在8︰1～12︰1（mL/g）范围内，萃取率保持稳定且有所降低。这可能是液料比的增加使物料中槟榔碱分子与溶剂分子碰撞概率增大，促进槟榔碱向溶剂中转移，表现为萃取率升高[25]。但继续增加液料比，物料中其他脂溶性成分竞争性溶出，进而影响目标成分的浸出。考虑到后续脱溶工序效率及能耗，液料比选择8︰1（mL/g）较为合适。

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据试验因素水平表和Box-Behnken试验设计方案进行试验，得到试验结果，响应面试验设计及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果

采用Box-Behnken设计原理对表2中的试验结果，进行多元线性回归和二项拟合分析，建立回归方程预测模型，得到回归方程Y=1.52+0.15A+0.11B+0.14C+0.022AB+0.053AC-0.067BC+0.016A2-0.13B2-0.23C2。

2.2.2 模型方差分析

对所得多元二次回归响应面模型进行方差分析，验证回归模型和各因素显著性。方差分析数据见表3。

表3 回归模型方差分析表

由表3可知，回归模型的差异极显著（对应P值为0.000 1＜0.01），失拟项不显著（对应P值为0.358 8＞0.05），说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，拟合的回归方程适应性较好。变异系数C.V.=4.08%＜10%，表明试验的可信度和精确度高。模型多元回归系数R2=0.922 7，且Radj2（0.937 6）和Rpred2（0.753 6）较接近，两者差值小于0.2，表明回归模型相关性好，能够充分分析和预测各因素对槟榔碱萃取率影响。

由方差分析表可知：一次项萃取时间（A）、液料比（B）和萃取温度（C）对槟榔碱萃取率的影响均极显著；二次项B2、C2影响极显著，但A2影响不显著；交互项中仅BC对萃取率影响显著，其余两组影响不显著。

2.2.3 各因素交互作用分析

运用软件Design-Expert 8.0.6中的Model Graphs模块绘制响应面等高线图，分析萃取时间、液料比和萃取温度对槟榔碱萃取率影响。固定其中1个因素时，可用等高线图评估其他2个因素间的交互作用对响应值的影响。等高线越接近椭圆形，则两因素间的交互作用越强，若等高线越接近圆形，则两因素间交互作用几乎可忽略[26-27]。

从图5可以看出，3组等高线图弯曲程度排序为BC＞AC＞AB，表明萃取温度（C）和液料比（B）两因素间交互作用最强，萃取温度和萃取时间（A）两因素间交互作用次之，萃取时间和液料比两因素间交互作用最弱，这也与方差分析中回归模型相应的系数大小及显著性趋势相一致。液料比和萃取温度间交互作用等高线图相较另外2组更接近椭圆，回归模型方差分析显示其P值为0.044 5＜0.05，表明差异显著。

图5 各因素交互作用对槟榔碱萃取率影响的响应曲面等高线图

2.2.4 理想优化参数及验证试验

采用Design-Expert 8.0.6软件对所得回归方程进行求解，得到理想条件参数：萃取时间40 min、液料比8.8︰1（mL/g）、萃取温度46.83 ℃。在此条件下，预测槟榔碱萃取率有1.74 mg/g。为便于试验操作，调整部分参数，即萃取时间40 min、液料比9︰1（mL/g）、萃取温度47 ℃。在此条件下进行验证试验，槟榔碱萃取率为1.77 mg/g，与预测值相近，表明该条件参数可靠，具有使用价值。采用优化参数对副产物槟榔芯共提取4次，油状萃取物收率有1.2%，总槟榔碱萃取率可达4.46 mg/g。

2.3 萃取物中槟榔碱HPLC检测谱图分析

如图6所示，对照品谱图中槟榔次碱（9.778 min）、去甲基槟榔次碱（12.404 min）、槟榔碱（14.813 min）和去甲基槟榔碱（17.415 min）依次出峰。样品（萃取物）谱图中只有1个主峰，出峰时间为14.816 min，与对照品谱图中的槟榔碱出峰时间（14.813 min）一致，表明萃取物中有槟榔碱成分，且萃取物中生物碱主要是槟榔碱。

图6 4种生物碱对照品和萃取物HPLC谱图

3 结论

通过单因素试验和BBD法响应面优化试验确定亚临界丁烷萃取副产物槟榔芯中槟榔碱的最佳工艺条件，即萃取时间40 min，液料比9︰1（mL/g），萃取温度47 ℃。在此条件下进行单次萃取，槟榔碱萃取率为1.77 mg/g，共提取4次，油状萃取物收率有1.2%，总槟榔碱萃取率可达4.46 mg/g。且萃取物经HPLC检测，与4种槟榔主要生物碱对照品比对，仅观察到槟榔碱出峰，表明萃取物中生物碱类成分主要是槟榔碱。

亚临界丁烷萃取工艺具低温特点，这较大程度地避免副产物槟榔芯中生物碱类的氧化、分解，具有显著进步，且该优化参数稳定可靠，可为开发槟榔资源提供参考。