新疆黑枸杞原花青素的提取及抗氧化活性研究

张荣，古丽吉合热·阿布拉

新疆第二医学院（克拉玛依 834000）

黑枸杞（Lycium ruthenicum）是枸杞属（Lycium）茄科（Solanceae）的多年灌木野生荒漠植物，果实成熟呈近卵球形，为蓝紫色，有淡淡的甜味，属平性药物，能够清热解毒，拥有非常良好的药用价值和食用价值[1]。黑枸杞主要在月经不调、增强免疫功能、延缓肌体衰老等方面有显著作用[2]。黑枸杞果实含有多糖、总黄酮、蛋白质等[3-4]多种天然活性的营养成分，其中原花青素的含量远高于其他天然植物，是最有效的天然抗氧化剂[5-9]。黑枸杞作为提取原花青素的理想植物，具有广阔的应用空间[10]。

20世纪50年代，法国科学家Jacque Masqulier首次从松树皮中提取原花青素，之后原花青素被发现更多来源，并得到广泛的研究和利用[11]。原花青素作为天然强有效的自由基清除剂，能有效清除OH-，O2-、NO-、DPPH等多种自由基，具有舒张血管、降糖、降血脂[12-16]、抑制肾功能和肠功能障碍、提高记忆力、抗肥胖、美白等保健食疗作用[17-20]。原花青素分子结构中含有不对称的碳原子，具有旋光性；分子带有多个酚羟基，极性较强，易溶于水、乙醇、甲醇等，不溶于乙醚、氯仿、苯等有机溶剂；分子中存在苯环结构，在紫外光区吸收较强[21-22]。

原花青素具有很好的药理作用，获得原花青素的提取工艺就显得尤为重要。故试验探究黑枸杞原花青素最优提取工艺，并分别考察黑枸杞原花青素提取物对DPPH自由基清除作用、OH-自由基清除作用、总还原能力，以期为黑枸杞原花青素进一步研究奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁标准品（98%，北京索莱宝科技有限公司）；NaOH（分析纯，天津市北联精细化学试剂有限公司）；NaNO2、硝酸铝（分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）；蒸馏水（实验室自制）；黑枸杞（新疆阿克苏）；DPPH（分析纯，Solarbio）；磷酸盐缓冲溶液（分析纯，Biosharp）；铁氰化钾（分析纯，天津市北联精细化学试剂有限公司）；三氯乙酸（分析纯，上海山蒲化工有限公司）；FeCl3、30%过氧化氢（分析纯，天津市北联精细化学试剂有限公司）；FeSO4（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；水杨酸（分析纯，天津市北联精细化学试剂有限公司）；抗坏血酸（分析纯，天津市天新精细化工有限公司）。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计（UV1801G，天津冠泽科技有限公司）；电子天平（YP202N，上海菁海仪器有限公司）；超声仪（KQ3200DE，昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）。

1.3 研究方法

1.3.1 原花青素含量的测定

1.3.1.1 芦丁标准品溶液的配制

精确称取5 mg干燥至恒重的芦丁标准品于烧杯，加入少量的无水乙醇溶解，加入蒸馏水定容至25 mL容量瓶中，摇匀，配成0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.3.1.2 原花青素吸收峰确定

取一定量0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液于25 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min后，加0.4 mL 10%硝酸铝，放置6 min，加4 mL 4%氢氧化钠，加蒸馏水至刻度摇匀，放置15 min，得显色液。配成的显色液使用紫外可见分光光度计进行全波长扫描，并使之吸光度（A）在0.2～0.8范围内。确定在510 nm波长处有最大吸收峰。

1.3.1.3 标准曲线的绘制

分别精密吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL标准品溶液于25 mL容量瓶中，依次加入0.4 mL 5%亚硝酸钠，0.4 mL 10%硝酸铝，加各溶液后要放置6 min，加4 mL 4%氢氧化钠，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15 min，于波长510 nm处测定吸光度，以对照品溶液浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，进行线性回归，根据文献[22-23]蓝莓花青素的提取工艺并稍作修改。

1.3.2 黑枸杞原花青素的提取

将黑枸杞粉碎，过0.250 mm（60目）筛，称取2.0 g于圆底烧瓶中，按一定超声提取时间、提取温度、乙醇体积分数处理，待提取液冷却后过滤，将提取液置于容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度后，配成供试品溶液。取1.0 mL按1.3.1.2项下的方法测定吸光度，带入回归方程计算原花青素浓度，按照式（1）计算其得率。

1.3.2.1 单因素试验

1.3.2.1.1 不同提取时间对原花青素得率的影响

称取5份2.0 g过0.250 mm（60目）筛的黑枸杞粉末，分别置于圆底烧瓶中，使用70%乙醇作为溶剂在提取温度60 ℃下，用超声仪测定提取时间15，30，60，90和120 min对黑枸杞原花青素得率的影响。

1.3.2.1.2 不同提取温度对原花青素得率的影响

称取5份2.0 g过0.250 mm（60目）筛的黑枸杞粉末，分别置于圆底烧瓶中，使用70%乙醇作为溶剂在提取时间60 min下，用超声仪测定提取温度30，40，50，60和70 ℃对黑枸杞原花青素得率的影响。

1.3.2.1.3 不同乙醇体积分数对原花青素得率的影响

称取5份2.0 g过0.250 mm（60目）的黑枸杞粉末，分别置于圆底烧瓶中，使用70%乙醇作为溶剂在提取时间60 min下，用超声仪测定乙醇体积分数10%，30%，50%，70%和95%对黑枸杞原花青素得率的影响。

1.3.2.2 正交试验

通过单因素试验，筛选出最佳提取时间、提取温度、乙醇体积分数，并分别选取最佳条件的前后1组条件进行三因素三水平正交试验。

1.3.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性试验

1.3.3.1 黑枸杞原花青素对DPPH自由基的清除作用

参考张欣[24]采用DPPH自由基清除率法，精密称取4.4 mg DPPH，使用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到0.04 mg/mL的DPPH溶液。将黑枸杞原花青素提取物分别配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列浓度。分别取2 mL不同质量浓度的待测液，加2 mL DPPH溶液，在室温下反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度，此处吸光度为A1。取2 mL DPPH溶液和2 mL 70%乙醇在室温下反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度，此处吸光度为A0。分别取2 mL不同质量浓度的待测液，加2 mL 70%乙醇，在室温下反应30 min后于波长517 nm处测定吸光度，此处吸光度为A2。以维生素C对照品为阳性对照，按式（2）计算清除率。

1.3.3.2 黑枸杞原花青素对OH-自由基的清除作用

参考闫莉莉等[25]采用的OH-自由基清除率法，将黑枸杞原花青素提取物，分别配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列浓度。分别取1 mL不同质量浓度的待测液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混匀，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min，在波长510 nm处测定吸光度，此处吸光度为Ax。取1 mL蒸馏水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL混匀，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min，在波长510 nm处测定吸光度，此处吸光度为A0。以维生素C对照品为阳性对照，按式（3）计算清除率。

1.3.3.3 黑枸杞原花青素的总还原能力

将原花青素提取物分别配制成0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL系列浓度。分别取1 mL不同质量浓度的待测液，加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混匀，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min，在波长510nm处测定吸光度，此处吸光度为Ax。取1 mL蒸馏水，其中加6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，混匀，加入3.0 mL 6.0 mmol/L水杨酸，摇匀，于37 ℃水浴加热30 min，在波长510 nm处测定吸光度，此处吸光度为A0。测定的样品吸光度越大，表示样品的总还原能力越强，以维生素C对照品为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

由图1可知，标准曲线回归方程为y=10.742x+0.004 1（R2=0.999 6），在0.008～0.05 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系。

图1 标准曲线

2.2 黑枸杞原花青素的提取试验结果

2.2.1 单因素试验结果

2.2.11 不同提取时间对原花青素得率的影响

由图2可知，原花青素得率呈现先上升再下降的变化趋势。在曲线顶部，即提取时间60 min处有最佳得率，为2.79%。时间大于60 min后，黑枸杞原花青素得率缓慢下降，故单因素试验选择提取时间60 min。

图2 不同提取时间对原花青素得率的影响

2.2.12 不同提取温度对原花青素得率的影响

由图3可得知，黑枸杞原花青素得率的曲线趋势与时间单因素曲线相近，也呈现先上升再徐徐下降趋势，其原花青素得率2.70%。故单因素试验选择提取温度60 ℃。

图3 不同提取温度对原花青素得率的影响

2.2.13 不同乙醇体积分数对原花青素得率的影响

由图4可知，原花青素得率随着乙醇体积分数增加而呈现先上升后下降趋势，在乙醇体积分数为70%时，原花青素最佳得率为2.76%。故单因素试验提取选择乙醇体积分数70%。

图4 不同乙醇体积分数对原花青素得率的影响

2.2.2 正交试验结果

在单因素试验基础上，以原花青素得率为指标，选取时间、提取温度、乙醇体积分数为自变量，设计L9(33)正交试验表（表1），结合正交表的条件进行试验，以确定黑枸杞原花青素的最佳提取工艺。

表1 正交设计因素水平

表2结果能展现黑枸杞原花青素得率的影响因子大小，即提取乙醇体积分数（C）＞提取时间（A）＞温度（B）。正交表优选的工艺为A2B2C2或A3B2C2，且提取时间和乙醇体积分数对黑枸杞原花青素的提取率影响较为明显。

表2 正交分布结果表

故综合所有结果，按照最优工艺A2B2C2，即提取时间60 mim、温度60 ℃、乙醇体积分数70%，进行验证试验，测得原花青素的得率为2.72%，与单因素试验结果基本一致。

2.3 黑枸杞原花青素的抗氧化活性试验结果

2.3.1 黑枸杞原花青素对DPPH自由基的清除作用

由图5可知，黑枸杞原花青素对DPPH自由基的清除率与质量浓度呈正相关，随着质量浓度不断增大，清除率随之增大，且高于相同质量浓度下维生素C的清除率，说明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。

图5 黑枸杞原花青素对DPPH自由基的清除作用

2.3.2 黑枸杞原花青素对OH-自由基的清除作用

由图6可知，原花青素清除率随着质量浓度增加呈现直线上升趋势，原花青素清除率高于相同质量浓度下维生素C的清除率，表明原花青素是一种有效的自由基清除剂。

图6 黑枸杞原花青素OH-自由基清除率作用

2.3.3 黑枸杞原花青素的总还原能力测定

由图7可知，原花青素与维生素C具有明显差异，并且吸光度呈随着质量浓度升高而增大趋势，相同质量浓度下原花青素的总还原能力高于维生素C的，表明原花青素具备较好的总还原能力。

图7 黑枸杞原花青素总还原能力

3 结论

通过提取工艺优化得出黑枸杞原花青素最佳提取条件：时间60 min、温度60 ℃、乙醇体积分数70%，原花青素得率为2.72%。原花青素得率受乙醇体积分数的影响最大。黑枸杞原花青素具有对DPPH、OH-自由基的清除作用，具有还原能力，结果表明原花青素的抗氧化能力与质量浓度有关系，而且高于相同质量浓度下维生素C。说明黑枸杞原花青素具有良好的抗氧化能力。试验结果为黑枸杞原花青素进一步研究奠定基础，为从黑枸杞中分离抗氧化活性成分和开发天然抗氧化剂提供一定依据，也为进一步深入研究开发和利用新疆黑枸杞资源提供理论参考。