国产离子色谱-自研脉冲安培检测器测定饮料中常见糖类化合物的含量

郎 蕾,刘格林,侯昆鹏,倪 彤,施超欧

(华东理工大学 化学与分子工程学院 分析测试中心,上海 200237)

糖类是植物和动物的主要能量来源,对生理活动等有着极大影响[1-2]。食品中常见的糖主要包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖等[3]。目前食品中糖的测定方法主要有化学法、酶比色法[4-6]、酶电极法[7-9]、高效液相色谱法[10-14]、气相色谱法[15]、毛细管电泳法[16-18]、高效阴离子交换色谱法[19-21]和分子印迹电化学传感器法[22]等。其中高效液相色谱法测定糖的分析方法主要包括高效液相色谱-示差折光法、高效液相色谱-蒸发光散射法和高效液相色谱-质谱法等。高效液相色谱-示差折光法只适用于等度洗脱的测试,且只适用于高含量糖样品的分析,在进行多组分分析时效果不好[23-24];高效液相色谱-蒸发光散射法对不挥发的待测物具有较高的检测灵敏度;蒸发光散射法不受溶剂成分及温度的影响,能够进行梯度洗脱的测试,适用于低聚糖的分析。高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)法采用氢氧化钠溶液为流动相,并添加乙酸钠,能实现糖醇、单糖、双糖、寡糖、低聚糖、多糖以及糖衍生物的分析。其在检测糖时主要使用配有金电极的脉冲安培检测器,可检测μg•L－1级的糖,不需要进行衍生反应[14-15]和复杂的样品纯化处理,基体干扰少,有着较好的方法重复性和稳定性[25]。但是,目前国内所有关于安培法测定糖含量的文献报道都使用进口检测器,至今未见国产安培检测器的应用报道。虽然2015年4月1日,国家重大科学仪器设备开发的离子色谱专项«多功能离子色谱仪的开发与产业化»中CIC-D500型多功能离子色谱仪样机亮相,但脉冲安培检测器仍然无法取得稳定良好的检测效果,目前还未出现可实用的国产脉冲安培检测器。

带脉冲安培检测器的进口离子色谱仪价格昂贵,维护费用高。因此,开发国产带脉冲安培检测器的离子色谱仪十分必要。本工作使用GI5000型离子色谱系统包含自研脉冲安培检测器测定饮料中常见的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖的含量,进行了相关的方法学验证,并分析了实际样品。与Thermo ICS 5000＋型离子色谱安培检测系统和Dionex Ultimate 3000型液相色谱示差检测器系统进行比较,以验证GI5000 型离子色谱系统在检测糖类化合物方面的可靠性,同时考察了国产自研安培检测器和国产泵与进口仪器的性能差距。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GI5000型离子色谱系统,包括GI3000软件、四元梯度泵、自动进样器和GI5250安培检测器(自研安培检测池、自研参比电极和自研金工作电极);Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统,包括变色龙7.2 软件、SP-DP 单元四元梯度泵、AS-AP自动进样器和DC模块(带原装安培检测器、安培检测池);Dionex Ultimate 3000 型液相色谱系统,包括变色龙6.8软件、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱和RI-101 示差折光检测器;Millipore-Q A10 型超纯水系统;AL204型电子天平。

5种糖类化合物混合标准储备溶液:1.000 g•L－1,称取葡萄糖51.0 mg、果糖50.5 mg、乳糖50.5 mg、蔗糖51.0 mg、麦芽糖51.0 mg,加水充分溶解后定容至50 mL,于4℃冰箱中冷藏保存,可放置15 d。使用时用水稀释至所需质量浓度。

D-无水葡萄糖、麦芽糖、无水乳糖的纯度不小于98%;D-果糖的纯度不小于99%;蔗糖的纯度不小于99.5%;50%(质量分数)氢氧化钠溶液为电子级;试验用水为超纯水(电阻率不低于18.2 MΩ•cm)。

可口可乐样品、样品1(脉动)和样品2(茶π),均在某超市购买。

所有试剂使用前均用0.22μm 滤膜过滤。

1.2 色谱条件

GI5000 型离子色谱系统和 Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统:Dionex CarboPac PA1色谱柱(250 mm×4 mm),Dionex CarboPac PA1 保护柱(50 mm×4 mm);柱温30 ℃;流量1 mL•min－1;进样量25μL;流动相为200 mmol•L－1氢氧化钠溶液;脉冲安培检测器电位波形为糖标准四电位。

Dionex Ultimate 3000 型液相色谱系统:Shodex-SP0810 色谱柱(300 mm×8.0 mm);柱温70 ℃;流量1 mL•min－1;进样量25μL;流动相为水。

1.3 试验方法

可口可乐溶液:先将可口可乐样品进行超声处理,用0.22μm 滤膜进行过滤,称取可口可乐样品126 mg,用水稀释50倍。

样品溶液:将样品1和样品2用0.22μm 滤膜进行过滤,再分别称取496 mg和507 mg于50 mL容量瓶中,加入水定容,得到质量浓度为9 920 mg•L－1和10 140 mg•L－1的两份实际样品溶液。使用时用水稀释至所需质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

5 mg•L－1的5种糖类化合物混合标准溶液在GI5000型离子色谱系统中的色谱图见图1。

图1 5种糖类化合物混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of five carbohydrate compounds

2.2 GI5000型离子色谱系统与Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统灵敏度对比

试验显示GI5000型离子色谱系统的噪声稳定在0.12 nC,而Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统的噪声稳定在0.02 nC,并进一步探索了造成这种现象的原因。首先将与检测器相连接的安培池体部件进行了拆卸,对自研金工作电极进行打磨维护,冲洗了自研参比电极,重新组装后安装在Thermo安培检测器上,用Thermo DP 泵进行测试,观察金工作电极噪声的变化,结果发现噪声稳定在0.02 nC,与进口安培池体噪声一致,排除了自研安培池体部件对噪声的影响。又将自研安培池体转移至GI5250安培检测器上,并与Thermo DP 泵串联起来进行测试,噪声稳定在0.06 nC,推测GI5250安培检测器和国产泵在稳定输出流动相上较进口仪器存在一定差距,但已符合日常的检测灵敏度的要求。使用3个月后,再次测试GI5000型离子色谱系统的噪声,稳定在0.12 nC,与试验初期噪声一致。再次将GI5250 安培检测器与Thermo DP 泵串联起来进行测试,噪声保持在0.06 nC 以下。说明GI5000型离子色谱系统和GI5250安培检测器稳定性良好。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线、检出限和测定下限

取适量的5种糖类化合物混合标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度为0.2,0.5,1.0,2.0,5.0 mg•L－1的5 种糖类化合物混合标准溶液系列。以糖类化合物的质量浓度为横坐标,对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,5种糖类化合物的质量浓度在0.2～5.0 mg•L－1内与对应的峰面积呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表1。

表1 GI5000型离子色谱系统测定5种糖类化合物的线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination for five carbohydrate compounds by GI5000 ion chromatograph system

按照3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),按照10倍信噪比计算测定下限(10S/N),结果见表1。

由表1 可知:5 种糖类化合物的检出限为3.420～31.37μg•L－1,小于NY/T 3902－2021«水果、蔬菜及其制品中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖的测定 离子色谱法»中的检出限(葡萄糖的检出限为0.4 mg•L－1、果糖和麦芽糖的检出限为1.2 mg•L－1、蔗糖的检出限为0.6 mg•L－1)。表明GI5000 型离子色谱系统所测得的结果,能满足上述标准的要求,可应用于日常实验室的检测。

Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统对葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖的检出限分别为1.200,1.830,2.960,6.230,10.15μg•L－1,测定下限分别为4.010,6.100,9.860,20.78,33.82μg•L－1。国产GI5000型离子色谱系统的检出限和测定下限约是上述进口仪器的3～4倍,灵敏度的差异造成了这样的结果。

2.3.2 进样重复性

取适量的5 mg•L－1的5种糖类化合物混合标准溶液于进样瓶中,分两批分别在GI5000 型离子色谱系统和Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统上重复进样8次,记录测得的峰高和峰面积,计算对应的相对标准偏差(RSD),结果如表2所示。

表2 5种糖类化合物进样重复性结果(n＝8)Tab.2 Results of repeated sampling of five carbohydrate compounds(n＝8)

由表2可知:GI5000型离子色谱系统中5种糖类化合物的峰高和峰面积的RSD 均小于2.5%,与Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统检测结果的RSD几乎一致,说明了GI5000型离子色谱系统进样重复性良好,其稳定性与进口仪器稳定性几乎相当。

2.3.3 精密度和回收试验

在国产GI5000 型离子色谱系统上,对可口可乐样品进行加标回收试验。加标量为样品中含有的糖类化合物质量分数的约80%,100%和120%,重复进样5次,计算峰面积的RSD 和回收率,结果如表3所示,图2为可口可乐样品的色谱图。

表3 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

图2 可口可乐样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of Coca Cola sample

由表3可知,样品中5种糖类化合物的回收率为94.1%～114%,RSD为0.15%～4.2%。经换算,可口可乐样品中葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖的质量浓度分别为41.6,54.4,1.5,4.1,1.8 g•L－1,总含糖量为103.4 g•L－1,可口可乐厂家标注碳水化合物总量为104.6 g•L－1,相对误差为－1.2%,说明GI5000型离子色谱系统检测结果可靠。

2.4 3种仪器检测结果对比

采用离子色谱法分析时将样品1,2 稀释100倍,液相色谱法分析时将样品1,2稀释10倍。分别在全进口仪器Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统、GI5000 型离子色谱系统以及Dionex Ultimate 3000型液相色谱仪上重复进样5针,测试结果如表4所示。

表4 样品1和样品2中含糖量测定结果Tab.4 Determination results of sugar content in sample 1 and sample 2

3种仪器对两种样品的分离色谱图如图3所示。

图3 样品1和样品2中糖分离色谱图Fig.3 Separation chromatograms of sugars in sample 1 and sample 2

样品1和样品2厂家标注的总含糖量分别为49 g•L－1和75 g•L－1。由表4可知,全进口仪器Thermo ICS 5000＋型多功能离子色谱系统测得两种样品的总含糖量分别为48.43,77.84 g•L－1,GI5000型离子色谱系统测得两种样品的总含糖量分别为48.80,74.77 g•L－1。Dionex Ultimate 3000型液相色谱仪测得两种样品的总含糖量分别为49.62,76.66 g•L－1。3种仪器所测得的两种样品中糖类化合物总量相对偏差的绝对值在3.0%以内,结果均较为准确,进一步证明了GI5000型离子色谱系统性能稳定,可以用于日常的检测分析。

本工作通过将GI5250安培检测器和进口仪器相互串联等得到GI5000型离子色谱系统的检出限和测定下限约为全进口仪器的3～4 倍,其原因是GI5250安培检测器自身性能与进口检测器存在差距,并且进口泵在稳定输出流动相上优于国产泵。后续需要针对国产安培检测器和泵性能进一步优化。使用GI5000型离子色谱系统测定饮料中糖类化合物的含量,并进行了方法学验证,同时与Thermo ICS 5000＋型离子色谱系统和Dionex Ultimat 3000型液相色谱仪比对,三者的结果一致,验证了GI5000型离子色谱系统在检测糖类化合物方面的可靠性。自研的脉冲安培检测器能够满足相关检测标准的要求,可满足实验室日常糖类化合物检测的需求。